Eine konvergierende Strategie für die Generierung einer virtually Sequenced cDNA Library aus unreferenzierten pazifischen Austern
Summary
Wir beschreiben eine Strategie, wie MAN RNA-Proben aus nicht referenzierten pazifischen Austernproben verwendet, und bewerten das genetische Material im Vergleich mit öffentlich verfügbaren Genomdaten, um eine virtuell sequenzierte cDNA-Bibliothek zu erzeugen.
Abstract
Der Zugang zu biologischem Material von Referenzarten, die zuvor in Schlüsselexperimenten wie der Entwicklung neuartiger Zelllinien oder Genomsequenzierungsprojekten verwendet wurden, ist aufgrund der verbrauchsfähigkeit der Proben. Obwohl sie inzwischen weit verbreitet sind über die Pazifikküsten Asiens, Australiens und Nordamerikas, sind einzelne pazifische Austernexemplare genetisch sehr vielfältig und daher nicht direkt als Ausgangsmaterial für Genbibliotheken geeignet. In diesem Artikel zeigen wir die Verwendung von unreferenzierten pazifischen Austernproben, die aus regionalen Fischmärkten gewonnen werden, um cDNA-Bibliotheken zu generieren. Diese Bibliotheken wurden dann mit dem öffentlich zugänglichen Austerngenom verglichen, und die engste verwandte Bibliothek wurde mit den mitochondrialen Referenzgenen Cytochrome C Oxidase Subunit I (COX1) und NADH Dehydrogenase (ND) ausgewählt. Die Eignung der generierten cDNA-Bibliothek wird auch durch Klonen und Expression von zwei Genen demonstriert, die die Enzyme UDP-Glucuronsäure-Dehydrogenase (UGD) und UDP-Xylose-Synthase (UXS) kodieren, die für die Biosynthese von UDP-Xylose aus UDP-Glucose.
Introduction
Der Erwerb von lebendem biologischem Material kann aufgrund langer Lieferzeiten, unternehmerischer Argumentation oder länderspezifischer Zollvorschriften eine Herausforderung darstellen. Alternativ kann das benötigte biologische Material auch aus phänotypisch identischen Proben entnommen werden. Diese Proben können jedoch auf der Ebene des Genotyps erheblich variieren, und daher werden Vergleiche mit digital gespeicherten Referenzgenomen derselben Art aufgrund der Inkompatibilität des neu beschafften Materials mit bestehenden DNA-Amplifikationsmethoden. Die Sequenzierung hochkonservierter Gene einzelner Proben ist ein weit verbreitetes und leistungsfähiges Werkzeug zur Identifizierung von Arten1, wie konservierte mitochondriale Gene, die häufig als Referenzgene für die Qualitätsbewertung von cDNA-Bibliotheken verwendet werden2 ,3,4,5,6. Die zugrunde liegende Begründung für die hier vorgestellte Methode ist, dass eine hohe Konservierung von mitochondrialen Gensequenzen in einzelnen anonymen Austernproben im Vergleich zu den entsprechenden Sequenzen des Referenzgenoms darauf hindeutet, dass andere Gene geringe Divergenz angesichts der im Allgemeinen schnelleren Rate der mitochondrialen DNA-Evolution im Vergleich zur Kern-DNA7, die die Amplifikation und Isolierung einer Vielzahl wissenschaftlich und industriell relevanter Gene ermöglicht, indem einfach öffentlich verfügbaren Sequenzierungsdaten als Referenz.
Das übergeordnete Ziel der hier beschriebenen Methode ist es, einen optimierten Workflow für die Erzeugung einer virtuell sequenzierten Austern-cDNA-Bibliothek zu präsentieren, die als Vorlagen-DNA für das Klonen von Austerngenen verwendet werden kann. Bei der virtuellen Sequenzierung wird die de novo genome Sequenzierung umgangen; Stattdessen wird eine bekannte, digital gespeicherte Referenzsequenz direkt verwendet, um Primer für die Produktion von cDNAs zu verwenden oder zu entwerfen, die schließlich eine Bibliothek umfassen (oder einer bereits vorhandenen Bibliothek hinzugefügt werden). Ziel ist es, eine konvergente cDNA-Bibliothek zu erzeugen, was bedeutet, dass Ähnlichkeiten zwischen den generierten cDNA-Sequenzen und der Referenzsequenz von niedriger bis hoher Divergenz geordnet werden können. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung der Cytochrom C Oxidase Untereinheit 1 (COX1) und NADH Dehydrogenase (ND) als Referenzgene ist, dass aufgrund der hohen Konservierung dieser mitochondrialen Gene auch stark geographisch disjunkte Austernproben profiliert werden können. Nachdem wir den Ansatz mit diesen etablierten Markern nachgewiesen haben, zeigen wir seine Anwendung bei zwei Enzymkandidaten, die an der Zuckernukleotid-Biosynthese beteiligt sind und von industrieller Relevanz sein können8,9, 10. Das biotechnologische Potenzial der pazifischen Auster ist noch unerforscht. Daher glauben wir, dass diese konvergierende Methode zur Vorbereitung einer virtuell sequenzierten cDNA-Bibliothek auch für nicht spezialisierte Forscher geeignet sein wird, die aus diesem relevanten biologischen Material cDNA erzeugen möchten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorgestellte Protokoll ermöglicht die genetische Identifizierung von nicht referenzierten Austernproben mit ähnlichem Phänotyp aus regionalen Fischmärkten im Vergleich der COX1- und ND-Gene mit einer öffentlich zugänglichen Austern-DNA-Genomdatenbank. Die Bedeutung dieser Methode liegt in ihrer Einfachheit, da für die Auswertung der virtuellen cDNA-Bibliothek nur eine einzige PCR-Reaktion erforderlich ist. Die beiden konservierten mitochondrialen COX1- und ND-Gene wurden aus einer cDNA-Bibliothek verstärkt, d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise von der Natural Science Foundation of China (Grant-Nummern 31471703, A0201300537 und 31671854 an J.V. und L.L., Grant-Nummer 31470435 an G.Y.) und dem 100 Foreign Talents Plan (Grant-Nummer JSB2014012 an J.V.) unterstützt.
Materials
| Chemicals: | |||
| 1% Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | *Alternative distributors possible |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Alfa Aesar | 490-79-9 | *Alternative distributors possible |
| Acetonitrile | Merck | 75-05-8 | *Alternative distributors possible |
| Agarose for molecular biology | Biowest Chemicals | 111860 | *Alternative distributors possible |
| Ampicilin | Solarbio | 69-52-3 | *Alternative distributors possible |
| Chloroform | Lingfeng, Shanghai | 67-66-3 | *Alternative distributors possible |
| DEPC water | Thermo Scientific | R0601 | |
| Ethanol | Jinhuada, Guangzhou | 64-17-5 | *Alternative distributors possible |
| Guanidinium thiocyanate-phenol reagent | Invitrogen | 15596018 | TRIzol reagent |
| Imidazole | Energy Chemical | 288-32-4 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl alcohol | Nanjing Chemical Reagent | 67-63-0 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside | Solarbio | 367-93-1 | *Alternative distributors possible |
| Kanamycin | Solarbio | 25389-94-0 | *Alternative distributors possible |
| LB Agar | Thermo Fisher | 22700025 | *Alternative distributors possible |
| LB Broth | Thermo Fisher | 10855021 | *Alternative distributors possible |
| Methanol | Jinhuada, Guangzhou | 67-56-1 | *Alternative distributors possible |
| MgCl2 hexahydrate | Xilong Huagong | 7791-18-6 | *Alternative distributors possible |
| NaCl | Xilong Huagong | 7647-14-5 | *Alternative distributors possible |
| NAD+ | Duly Biotech | 53-84-9 | *Alternative distributors possible |
| Phenyl-methylsulfonyl fluoride | Macklin | 329-98-6 | *Alternative distributors possible |
| Tris | Solarbio | 77-86-1 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucose | Wuhu Nuowei Chemicals | 28053-08-9 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucuronic acid | SIGMA | 63700-19-6 | *Alternative distributors possible |
| Tools/Instruments: | |||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | *Alternative distributors possible |
| Metal block heater | Long Yang Scientific Instruments | Thermoshaker HB20 | *Alternative distributors possible |
| PCR thermocycler | Hema | 9600 | *Alternative distributors possible |
| Enzyme and Kits: | |||
| 10×Ligation buffer | Thermo Scientific | B69 | *Alternative distributors possible |
| 5×PrimeSTAR buffer | Takara | 9158A | |
| Alkaline phosphatase | ThermoFisher FastAP | EF0654 | *Alternative distributors possible |
| COX forward primer | Genscript | ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG | |
| COX reverse primer | Genscript | ACTTGACCAAAAACATAAGACATG | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B7204S | *Alternative distributors possible |
| dNTP mix | Invitrogen | 18427088 | |
| MgUGD forward primer | Genscript | ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT | |
| MgUGD reverse primer | Genscript | ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG | |
| MgUXS forward primer | Genscript | CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC | |
| MgUXS reverse primer | Genscript | ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT | |
| ND forward primer | Genscript | ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT | |
| ND reverse primer | Genscript | ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC | |
| PCR Cleanup Kit | AxyGen | AP-PCR-250 | *Alternative distributors possible |
| pET-30a(+) vector | Merck Millipore | 69909 |
References
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