Мы описываем стратегию использования образцов РНК из неупомянутых образцов тихоокеанских устриц и оцениваем генетический материал по сравнению с общедоступными данными генома для создания практически секвенируемой библиотеки кДНК.
Доступ к биологическому материалу эталонных видов, которые ранее использовались в ключевых экспериментах, таких как разработка новых клеточных линий или проектов секвенирования генома, часто трудно предусмотреть для дальнейших исследований или третьих сторон из-за расходный характер образцов. Хотя в настоящее время широко распространены на тихоокеанском побережье Азии, Австралии и Северной Америки, отдельные образцы тихоокеанских устриц генетически довольно разнообразны и поэтому не подходят непосредственно в качестве исходного материала для библиотек генов. В этой статье мы демонстрируем использование неупомянутых тихоокеанских устриц, полученных на региональных рынках морепродуктов для создания библиотек кДНК. Затем эти библиотеки были сравнены с общедоступным геномом устриц, и ближайшая соответствующая библиотека была выбрана с использованием митохондриальных эталонных генов Cytochrome C Oxidase subunit I (COX1) и NADH Dehydrogenase (ND). Пригодность генерируемой библиотеки кДНК также демонстрируется путем клонирования и экспрессии двух генов, кодирующих ферменты UDP-глюкуроновая кислота дегидрогеназы (UGD) и udP-xylose synthase (UXS), которые отвечают за биосинтез UDP-xylose от УДП-глюкоза.
Приобретение живого эталонного биологического материала может быть сложным из-за длительного срока поставки, предпринимательских рассуждений или таможенных правил, касающихся конкретных стран. В качестве альтернативы необходимый биологический материал может быть также собран из фенотипически идентичных образцов. Однако эти образцы могут значительно различаться на уровне генотипа, и поэтому сравнения с цифровыми эталонными геномами одного и того же вида часто оказываются трудными или даже бесполезными из-за несовместимости вновь полученного материала с существующих методов усиления ДНК. Секвенирование высоко сохранимых генов отдельных образцов являетсяшироко используемым и мощным инструментом для идентификации видов 1, таких как сохраненные митохондриальные гены, которые часто используются в качестве эталонных генов для оценки качества библиотек кДНК2 ,3,4,5,6. Основное обоснование представленного метода заключается в том, что высокая сохранность последовательностей митохондриальных генов в отдельных анонимных образцах устриц по сравнению с соответствующими последовательностями эталонного генома указывает на то, что другие гены могут также показывать низкий уровень дивергенции, учитывая в целом более высокуюскорость эволюции митохондриальной ДНК по отношению к ядерной ДНК 7, что позволяет усиление и изоляцию широкого спектра научно и промышленно значимых генов, просто используя публично доступные данные последовательности в качестве эталона.
Общая цель описанного в настоящем методе состоит в том, чтобы представить оптимизированный рабочий процесс для создания практически секвенированной библиотеки кДНК устрицы, которая может быть использована в качестве шаблона ДНК для клонирования генов устриц. При виртуальном секвенировании секвенирования генома de novo обходится; вместо этого, известная, цифрово-сохраненная справочная последовательность используется непосредственно для использования или разработки праймеров для производства cDNA, которые в конечном итоге будут состоять из библиотеки (или будут добавлены к уже существующей последовательной). Цель состоит в том, чтобы создать конвергентную библиотеку кДНК, что означает, что сходство между сгенерированными последовательностями кДНК и эталонной последовательностью может ранжироваться от низкого к высокому расхождению. Ключевым преимуществом использования Cytochrome C Oxidase subunit 1 (COX1) и NADH Dehydrogenase (ND) в качестве эталонных генов является то, что даже высоко географически разъединяющие образцы устриц могут быть профилированы из-за высокой консервации этих митохондриальных генов. Доказав подход с этими устоявшимися маркерами, мы затем демонстрируем его применение к двум ферментнымкандидатам, которые участвуют в биосинтезе нуклеотида сахара и могут иметь промышленное значение 8,9, 10. Биотехнологический потенциал тихоокеанской устрицы до сих пор не изучен. Таким образом, мы считаем, что этот сходящийся метод для подготовки практически секвенированных библиотеки кДНК также будет подходящим для неспециалистов исследователей, которые хотят генерировать кДНК из этого соответствующего биологического материала.
Представленный протокол позволяет генетическую идентификацию неупомянутых образцов устриц с аналогичным фенотипом региональных рынков морепродуктов путем сравнения генов COX1 и ND с общедоступной базой данных генома ДНК устриц. Значение этого метода заключается в его простоте, так ка?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана Фондом естественных наук Китая (грант ы 31471703, A0201300537 и 31671854 до J.V. и L.L., грант номер 31470435 для G.Y.), и 100 иностранных талантов плана (грант номер JSB2014012 до J.V.).
Chemicals: | |||
1% Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | *Alternative distributors possible |
2,5-Dihydroxybenzoic acid | Alfa Aesar | 490-79-9 | *Alternative distributors possible |
Acetonitrile | Merck | 75-05-8 | *Alternative distributors possible |
Agarose for molecular biology | Biowest Chemicals | 111860 | *Alternative distributors possible |
Ampicilin | Solarbio | 69-52-3 | *Alternative distributors possible |
Chloroform | Lingfeng, Shanghai | 67-66-3 | *Alternative distributors possible |
DEPC water | Thermo Scientific | R0601 | |
Ethanol | Jinhuada, Guangzhou | 64-17-5 | *Alternative distributors possible |
Guanidinium thiocyanate-phenol reagent | Invitrogen | 15596018 | TRIzol reagent |
Imidazole | Energy Chemical | 288-32-4 | *Alternative distributors possible |
Isopropyl alcohol | Nanjing Chemical Reagent | 67-63-0 | *Alternative distributors possible |
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside | Solarbio | 367-93-1 | *Alternative distributors possible |
Kanamycin | Solarbio | 25389-94-0 | *Alternative distributors possible |
LB Agar | Thermo Fisher | 22700025 | *Alternative distributors possible |
LB Broth | Thermo Fisher | 10855021 | *Alternative distributors possible |
Methanol | Jinhuada, Guangzhou | 67-56-1 | *Alternative distributors possible |
MgCl2 hexahydrate | Xilong Huagong | 7791-18-6 | *Alternative distributors possible |
NaCl | Xilong Huagong | 7647-14-5 | *Alternative distributors possible |
NAD+ | Duly Biotech | 53-84-9 | *Alternative distributors possible |
Phenyl-methylsulfonyl fluoride | Macklin | 329-98-6 | *Alternative distributors possible |
Tris | Solarbio | 77-86-1 | *Alternative distributors possible |
UDP-glucose | Wuhu Nuowei Chemicals | 28053-08-9 | *Alternative distributors possible |
UDP-glucuronic acid | SIGMA | 63700-19-6 | *Alternative distributors possible |
Tools/Instruments: | |||
MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | *Alternative distributors possible |
Metal block heater | Long Yang Scientific Instruments | Thermoshaker HB20 | *Alternative distributors possible |
PCR thermocycler | Hema | 9600 | *Alternative distributors possible |
Enzyme and Kits: | |||
10×Ligation buffer | Thermo Scientific | B69 | *Alternative distributors possible |
5×PrimeSTAR buffer | Takara | 9158A | |
Alkaline phosphatase | ThermoFisher FastAP | EF0654 | *Alternative distributors possible |
COX forward primer | Genscript | ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG | |
COX reverse primer | Genscript | ACTTGACCAAAAACATAAGACATG | |
Cutsmart Buffer | NEB | B7204S | *Alternative distributors possible |
dNTP mix | Invitrogen | 18427088 | |
MgUGD forward primer | Genscript | ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT | |
MgUGD reverse primer | Genscript | ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG | |
MgUXS forward primer | Genscript | CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC | |
MgUXS reverse primer | Genscript | ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT | |
ND forward primer | Genscript | ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT | |
ND reverse primer | Genscript | ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC | |
PCR Cleanup Kit | AxyGen | AP-PCR-250 | *Alternative distributors possible |
pET-30a(+) vector | Merck Millipore | 69909 |