En konvergerande strategi för generering av ett virtuellt sekvenserat cDNA-bibliotek från orefererade Pacific Oysters
Summary
Vi beskriver en strategi för hur man använder RNA-prover från orefererade Pacific Oyster-prover, och utvärderar det genetiska materialet i jämförelse med allmänt tillgängliga genomdata för att generera ett virtuellt sekvenserat cDNA-bibliotek.
Abstract
Tillgången till biologiskt material av referens arter, som tidigare använts i viktiga experiment, till exempel vid utveckling av nya cellinjer eller sekvenserings projekt, är ofta svåra att tillhandahålla för ytterligare studier eller tredje parter på grund av provtagens fullänkande karaktär. Även om det nu är vida spridda över Stillahavskusten i Asien, Australien och Nordamerika, är enskilda Pacific ostron exemplar genetiskt ganska varierande och är därför inte direkt lämpade som utgångsmaterial för gen bibliotek. I den här artikeln visar vi användningen av orefererade Pacific Oyster-prover som erhållits från regionala skaldjursmarknader för att generera cDNA-bibliotek. Dessa bibliotek jämfördes sedan med det allmänt tillgängliga ostron genomet, och det närmast relaterade biblioteket valdes med hjälp av mitokondriella referengener cytokrom C oxidas subenhet I (COX1) och NADH dehydrogenas (nd). Det genererade cDNA-bibliotekets lämplighet demonstreras också genom kloning och uttryck av två gener som kodar för enzymerna UDP-glukuronsyra-dehydrogenas (UGD) och UDP-Xylose syntas (UXS), som är ansvariga för biosyntesen av UDP-Xylose från UDP-glukos.
Introduction
Förvärvet av levande refererade biologiskt material kan vara utmanande på grund av långa leveranstider, företagande resonemang, eller landsspecifika tullbestämmelser. Som ett alternativ kan det erforderliga biologiska materialet också samlas in från fenotypiskt identiska prover. Dessa prover kan dock variera betydligt på genotyp nivå, och därför är jämförelser med digitalt lagrade referens genom av samma art ofta förorsakade svåra eller till och med meningslösa på grund av inkompatibilitet hos det nyligen inköpta materialet med befintliga DNA-amplifieringsmetoder. Sekvensering av mycket bevarade gener av enskilda prover är ett allmänt använt och kraftfullt verktyg för att identifiera arter1, såsom bevarade mitokondriella gener som ofta används som referengener för kvalitetsbedömningen av cDNA-bibliotek2 ,3,4,5,6. Den bakomliggande grunden för den här presenterade metoden är att högt bevarande av mitokondriella gensekvenser i enskilda anonyma ostron prov jämfört med motsvarande sekvenser av referensgenomet indikerar att andra gener också kan visa en låg nivå av avvikelser, med tanke på den allmänt snabbare graden av mitokondriell DNA-evolution i förhållande till nukleärt DNA7, vilket möjliggör förstärkning och isolering av ett brett spektrum av vetenskapligt och industriellt relevanta gener genom att helt enkelt använda offentligt tillgängliga sekvenserings data som referens.
Det övergripande målet för häri beskrivna metoden är att presentera ett optimerat arbetsflöde för att generera ett praktiskt taget sekvenserade Oyster cDNA bibliotek som kan användas som mall DNA för kloning av ostron gener. Vid virtuell sekvensering kringgås de Novo genomsekvenseringen. i stället används en känd, digitalt lagrad referenssekvens direkt för att använda eller designa primers för produktion av cDNAs som så småningom kommer att bestå av ett bibliotek (eller läggas till i en befintlig). Målet är att skapa ett konvergent cDNA-bibliotek, vilket innebär att likheter mellan de genererade cDNA-sekvenserna och referenssekvens kan rangordnas från låg till hög avvikelse. En viktig fördel med att använda cytokrom C oxidas subenhet 1 (COX1) och NADH dehydrogenas (nd) som referengener är att även mycket geografiskt det ostron exemplar kan profileras på grund av den höga bevarandet av dessa mitokondriella gener. Efter att ha bevisat tillvägagångssättet med dessa väletablerade markörer, visar vi sedan dess tillämpning på två enzym kandidater som är involverade i socker nukleotidbiosyntes och kan vara av industriell relevans8,9, 10. den biotekniska potentialen i stilla ostron är fortfarande outforskad. Därför anser vi att denna konvergerande metod för att förbereda ett virtuellt sekvenserat cDNA-bibliotek också kommer att vara lämplig för icke-specialiserade forskare som vill generera cDNA från detta relevanta biologiska material.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det presenterade protokollet tillåter genetisk identifiering av orefererade ostron exemplar med liknande fenotyp från regionala skaldjursmarknader genom jämförelse av COX1 och ND gener med en allmänt tillgänglig Oyster DNA Genome databas. Betydelsen av denna metod ligger i dess enkelhet, eftersom endast en enda PCR-reaktion behövs för utvärderingen av det virtuella cDNA-biblioteket. De två bevarade mitokondrierna COX1 och ND gener förstärkallades från ett cDNA bibliotek som genererades av omvänd Transkripti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av Natural Science Foundation i Kina (Grant nummer 31471703, A0201300537 och 31671854 till J.V. och ll, Grant nummer 31470435 till G.Y.), och 100 utländska talanger plan (bidrags nummer JSB2014012 till J.V.).
Materials
| Chemicals: | |||
| 1% Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | *Alternative distributors possible |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Alfa Aesar | 490-79-9 | *Alternative distributors possible |
| Acetonitrile | Merck | 75-05-8 | *Alternative distributors possible |
| Agarose for molecular biology | Biowest Chemicals | 111860 | *Alternative distributors possible |
| Ampicilin | Solarbio | 69-52-3 | *Alternative distributors possible |
| Chloroform | Lingfeng, Shanghai | 67-66-3 | *Alternative distributors possible |
| DEPC water | Thermo Scientific | R0601 | |
| Ethanol | Jinhuada, Guangzhou | 64-17-5 | *Alternative distributors possible |
| Guanidinium thiocyanate-phenol reagent | Invitrogen | 15596018 | TRIzol reagent |
| Imidazole | Energy Chemical | 288-32-4 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl alcohol | Nanjing Chemical Reagent | 67-63-0 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside | Solarbio | 367-93-1 | *Alternative distributors possible |
| Kanamycin | Solarbio | 25389-94-0 | *Alternative distributors possible |
| LB Agar | Thermo Fisher | 22700025 | *Alternative distributors possible |
| LB Broth | Thermo Fisher | 10855021 | *Alternative distributors possible |
| Methanol | Jinhuada, Guangzhou | 67-56-1 | *Alternative distributors possible |
| MgCl2 hexahydrate | Xilong Huagong | 7791-18-6 | *Alternative distributors possible |
| NaCl | Xilong Huagong | 7647-14-5 | *Alternative distributors possible |
| NAD+ | Duly Biotech | 53-84-9 | *Alternative distributors possible |
| Phenyl-methylsulfonyl fluoride | Macklin | 329-98-6 | *Alternative distributors possible |
| Tris | Solarbio | 77-86-1 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucose | Wuhu Nuowei Chemicals | 28053-08-9 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucuronic acid | SIGMA | 63700-19-6 | *Alternative distributors possible |
| Tools/Instruments: | |||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | *Alternative distributors possible |
| Metal block heater | Long Yang Scientific Instruments | Thermoshaker HB20 | *Alternative distributors possible |
| PCR thermocycler | Hema | 9600 | *Alternative distributors possible |
| Enzyme and Kits: | |||
| 10×Ligation buffer | Thermo Scientific | B69 | *Alternative distributors possible |
| 5×PrimeSTAR buffer | Takara | 9158A | |
| Alkaline phosphatase | ThermoFisher FastAP | EF0654 | *Alternative distributors possible |
| COX forward primer | Genscript | ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG | |
| COX reverse primer | Genscript | ACTTGACCAAAAACATAAGACATG | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B7204S | *Alternative distributors possible |
| dNTP mix | Invitrogen | 18427088 | |
| MgUGD forward primer | Genscript | ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT | |
| MgUGD reverse primer | Genscript | ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG | |
| MgUXS forward primer | Genscript | CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC | |
| MgUXS reverse primer | Genscript | ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT | |
| ND forward primer | Genscript | ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT | |
| ND reverse primer | Genscript | ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC | |
| PCR Cleanup Kit | AxyGen | AP-PCR-250 | *Alternative distributors possible |
| pET-30a(+) vector | Merck Millipore | 69909 |
References
- Blaxter, M. L. The promise of a DNA taxonomy. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).
- Wen, J., et al. Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market. Food Control. 90, 199-204 (2018).
- Zhang, H., et al. Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis. Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).
- Sell, J., Spirkovski, Z. Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation. Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).
- Karadjian, G., et al. Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).
- Morga, B., et al. Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR. Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).
- Delsuc, F., et al. Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes. Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).
- Wei, S., et al. Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila. Protein & Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).
- Gu, B., et al. Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus. Protein & Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).
- Duan, X. C., et al. Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
- Song, H. B., et al. UDP-glucose 4-epimerase and β-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600 (2018).
- Gainey, P. A., Phelps, C. F. Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans. Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).
