एक मेलेनोमा रोगी व्युत्पन्न Xenograft मॉडल
Summary
रोगी व्युत्पन्न xenograft (PDX) मॉडल अधिक मजबूती से मेलेनोमा आणविक और जैविक सुविधाओं recapitulate और पारंपरिक प्लास्टिक ऊतक संस्कृति आधारित परख की तुलना में चिकित्सा प्रतिक्रिया के अधिक भविष्य कहनेवाला हैं. यहाँ हम नए PDX मॉडल की स्थापना के लिए हमारे मानक ऑपरेटिंग प्रोटोकॉल और मौजूदा PDX मॉडल की विशेषता /
Abstract
एकत्र सबूत पता चलता है कि आणविक और जैविक गुण मानव रोगियों में vivo में बनाम पारंपरिक दो आयामी ऊतक संस्कृति वाहिकाओं में बड़े मेलेनोमा कोशिकाओं में अलग हैं. यह मेलेनोमा कोशिकाओं के क्लोनल आबादी की बाधा चयन के कारण है जो शारीरिक स्थितियों के अभाव में इन विट्रो में मजबूती से विकसित हो सकता है। इसके अलावा, दो आयामी ऊतक संस्कृतियों में चिकित्सा के लिए प्रतिक्रियाओं समग्र ईमानदारी से मेलेनोमा रोगियों में चिकित्सा के लिए प्रतिक्रियाओं को प्रतिबिंबित नहीं करते, नैदानिक परीक्षणों के बहुमत के साथ चिकित्सीय संयोजन की प्रभावकारिता दिखाने में सक्षम होने के लिए दिखाया गया है विट्रो. हालांकि चूहों में मेलेनोमा कोशिकाओं के xenografting दो आयामी ऊतक संस्कृति परख से अनुपस्थित vivo संदर्भ में शारीरिक प्रदान करता है, engraftment के लिए इस्तेमाल मेलेनोमा कोशिकाओं पहले से ही कोशिकाओं है कि के तहत विकसित हो सकता है के लिए bottleneck चयन आया है द्वि-आयामी स्थितियाँ जब कक्ष पंक्ति स्थापित की गई थी. बाधा ओंठ के परिणामस्वरूप होने वाले अपरिवर्तनीय परिवर्तनों में विकास और आक्रमण गुणों में परिवर्तन, साथ ही विशिष्ट उप-जनसंख्या के नुकसान शामिल हैं। इसलिए, मॉडल है कि बेहतर vivo में मानव हालत recapitulate बेहतर चिकित्सीय रणनीतियों है कि प्रभावी ढंग से metastatic मेलेनोमा के साथ रोगियों के समग्र अस्तित्व में वृद्धि की भविष्यवाणी कर सकते हैं. रोगी व्युत्पन्न xenograft (PDX) तकनीक एक माउस प्राप्तकर्ता के लिए मानव रोगी से ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष प्रत्यारोपण शामिल है. इस तरह, ट्यूमर कोशिकाओं को लगातार विवो में शारीरिक तनाव के तहत बड़े हो रहे हैं और दो आयामी बाधाओं से गुजरना कभी नहीं, जो आणविक और जैविक गुणों को बरकरार रखता है जब ट्यूमर मानव रोगी में था. उल्लेखनीय है, पीडीएक्स मॉडल मेटास्टेस के अंग साइटों से व्युत्पन्न (यानी, मस्तिष्क) इसी तरह मेटास्टैटिक क्षमता प्रदर्शित करते हैं, जबकि पीडीएक्स मॉडल चिकित्सा भोले रोगियों और चिकित्सा के लिए अधिग्रहीत प्रतिरोध के साथ रोगियों से व्युत्पन्न (यानी, BRAF/MEK अवरोधक चिकित्सा) प्रदर्शन चिकित्सा के लिए इसी तरह की संवेदनशीलता.
Introduction
पूर्व नैदानिक मॉडल translational कैंसर अनुसंधान के सभी पहलुओं के लिए महत्वपूर्ण हैं, रोग लक्षण सहित, सामान्य कोशिकाओं बनाम कैंसर के लिए अद्वितीय कार्रवाई कमजोरियों की खोज, और प्रभावशाली उपचार है कि शोषण के विकास इन कमजोरियों रोगियों के समग्र अस्तित्व को बढ़ाने के लिए। मेलेनोमा क्षेत्र में, सेल लाइन मॉडल के हजारों के दसियों भारी दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया गया है, के साथ gt;4,000 अकेले हमारे समूह द्वारा योगदान (WMXXX श्रृंखला). इन सेल लाइन मॉडल त्वचीय मेलेनोमा के विभिन्न रूपों के साथ मेलेनोमा रोगियों से प्राप्त किए गए थे (यानी, acral, uveal, और सतही प्रसार) और विविध जीनोटाइप (यानी, BRAFV600-म्यूटेंट और neuroblastoma आरएएस वायरल oncogene homolog ] एनआरएएस Q61R-म्यूटेंट]), जो क्लिनिक में मौजूद रोग के स्पेक्ट्रम का विस्तार1,2.
असमान रूप से, मेलेनोमा क्षेत्र में सबसे सफल, लक्षित चिकित्सा रणनीति 1) रोगियों के ट्यूमर के जीनोमिक लक्षणीकरण से उभरा है जो मेलेनोमा3 के $50% में BRAF उत्परिवर्तनों की पहचान करता है और 2) पूर्व नैदानिक जांच से मेलेनोमा सेल लाइन मॉडल का लाभ4| BRAF/MEK अवरोधक संयोजन खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) था- 2014 में उन रोगियों के उपचार के लिए अनुमोदित किया गया था जिनके मेलेनोमा बीआरएएफ V600E/K उत्परिवर्तनों को सक्रिय करते हैं और एक और 75% प्रतिक्रिया दर5दावा करते हैं। इस प्रारंभिक प्रभावकारिता के बावजूद, प्रतिरोध तेजी से लगभग हर मामले में विविध आंतरिक और प्राप्त प्रतिरोध तंत्र और intratumoral विषमता के कारण उठता है. दुर्भाग्य से, सेल लाइन मॉडल प्रतिनिधि जैविक विषमता recapitulate नहीं है जब प्लास्टिक के जहाजों में दो आयामी संस्कृति में बड़े हो, जो मास्क उनके नैदानिक भविष्य कहनेवाला क्षमता जब जांचकर्ताओं प्रयोगात्मक निर्धारित करने का प्रयास उपचार है कि एक विशिष्ट रूप या मेलेनोमा के जीनोटाइप के साथ रोगियों में प्रभावी हो सकताहै 6. समझ कैसे सबसे अच्छा मॉडल रोगी intratumoral विषमता जांचकर्ताओं बेहतर चिकित्सीय तरीके है कि चिकित्सा प्रतिरोधी subpopulations कि वर्तमान मानक की देखभाल के उपचार के लिए विफलता ड्राइव को मार सकते हैं विकसित करने के लिए अनुमति देगा.
सेल लाइन मॉडल की सीमित भविष्य कहनेवाला मूल्य के लिए पैरामाउंट है कि वे कैसे शुरू में स्थापित कर रहे हैं. अपरिवर्तनीय परिवर्तन ट्यूमर क्लोनल परिदृश्य में होते हैं जब एक रोगियों के ट्यूमर के एकल सेल निलंबन दो आयामी, प्लास्टिक ऊतक संस्कृति वाहिकाओं पर उगाया जाता है, proliferative और इनवेसिव क्षमता में परिवर्तन सहित, विशिष्ट के उन्मूलन subpopulations, और आनुवंशिक जानकारी के परिवर्तन7| इन मेलेनोमा सेल लाइन मॉडल के चूहों में Xenografts पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए विवो मंच में सबसे अक्सर इस्तेमाल किया प्रतिनिधित्व करते हैं; हालांकि, इस रणनीति को भी जटिल ट्यूमर विषमता के गरीब recapitulation से ग्रस्त नैदानिक मनाया. इस कमी को दूर करने के लिए, वहाँ PDX मॉडल सहित मेलेनोमा के और अधिक परिष्कृत पूर्व नैदानिक मॉडल को शामिल करने में एक बढ़ती रुचि रही है. PDX मॉडल के लिए उपयोग किया गया है और 30 साल, फेफड़ों के कैंसर के रोगियों cytotoxic एजेंटों के लिए रोगियों की प्रतिक्रिया और एक ही रोगी से व्युत्पन्न PDX मॉडल की प्रतिक्रिया के बीच सामंजस्य का प्रदर्शन में मौलिक अध्ययन के साथ8. हाल ही में, वहाँ दोनों उद्योग में और शैक्षिक केन्द्रों में पूर्व नैदानिक जांच के लिए पसंद के उपकरण के रूप में PDX मॉडल का उपयोग करने के लिए एक अभियान किया गया है. PDX मॉडल, क्योंकि मानव रोगियों में ट्यूमर विषमता के अपने बेहतर recapitulation की, अधिक चिकित्सकीय सेल लाइन xenografts9की तुलना में चिकित्सा अनुकूलन प्रयासों में उपयोग करने के लिए प्रासंगिक हैं. मेलेनोमा में, वहाँ भारी बाधाओं है कि उन्नत रोग10के चिकित्सीय प्रबंधन कुंद कर रहे हैं. चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक PDX मॉडल नैदानिक प्रतिरोध मॉडल और चिकित्सकीय उपलब्ध एजेंटों के साथ चिकित्सकीय रणनीतियों की पहचान करने के लिए चिकित्सा प्रतिरोधी ट्यूमर11,12के इलाज के लिए इस्तेमाल किया गया है. संक्षेप में, पीडीएफ मॉडल उत्पन्न करने के लिए यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्राथमिक या मेटास्टैटिक मेलेनोमा से ताजा ऊतक के subcutaneous प्रत्यारोपण की आवश्यकता है (बायोप्सी या सर्जरी द्वारा एकत्र) NOD/ पद्धति संबंधी प्रकिया में विभिन्न विभिन्न विविधताओं का उपयोग विभिन्न समूहों द्वारा किया जाता है; हालांकि, एक मौलिक कोर13मौजूद है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहाँ प्राथमिक और metastatic ट्यूमर, कोर बायोप्सी, और FNAs से व्युत्पन्न रोगी ऊतक के साथ मेलेनोमा के PDX मॉडल पैदा करने का वर्णन किया है. जब सीधे एनएसजी चूहों में engrafted, ट्यूमर रोगी में मनाया उन लोगों के लिए इसी तरह morp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकWistar संस्थान पशु सुविधा, माइक्रोस्कोपी सुविधा, हिस्टोप्रौद्योगिकी सुविधा, और अनुसंधान आपूर्ति केंद्र धन्यवाद. इस अध्ययन के भाग में U54 से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया (CA224070-01), SPORE (CA174523), P01 (CA114046-07), डॉ मरियम और शेल्डन जी Adelson चिकित्सा अनुसंधान फाउंडेशन, और Melanoma अनुसंधान फाउंडेशन.
Materials
| 1 M Hepes | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # H0887-100ML | |
| 100x PenStrep | Invitrogen | Cat # 15140163 | |
| 1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) | MED | Cat # MT21-023-CV | |
| 2.5% Trypsin | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # T4549-100ML | 10 mL aliquots stored at –20oC |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # A9418-500G | |
| Chlorhexidine | Fisher Scientific | Cat# 50-118-0313 | |
| Collagenase IV (2,000 u/mL) | Worthington | Cat #4189 | make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1 |
| DMSO | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # C6295-50ML | |
| DNase | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # D4527 | |
| EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) | Merck | Cat # 324626.25 | |
| FBS | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 16000-044 | |
| Fungizone | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 15290-018 | |
| Gentamicin | FISHER SCIENTIFIC | Cat # BW17518Z | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | Cat # 050031 | |
| Leibovitz's L15 media | Invitrogen | Cat # 21083027 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354230 | Artificial extracellular matrix |
| Meloxicam | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein | Cat # 025115 | 1-5mg/kg, as painkiller |
| NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice | The Wistar Institute, animal facility | breeding | |
| PVA (polyvinyl alcohol) | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # P8136-250G | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Fisher Scientific | Cat# MT10041CM | |
| Scalpel | Feather | Cat # 2976-22 | |
| Virkon | GALLARD-SCHLESINGER IND | Cat # 222-01-06 | |
| Wound clips | MikRon | Cat #427631 |
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