黑色素瘤患者衍生异种移植模型
Summary
与传统的基于塑料组织培养的检测相比,患者衍生的异种移植 (PDX) 模型更有力地概括黑色素瘤分子和生物特征,并更预测治疗反应。在这里,我们描述了我们用于建立新的 PDX 模型的标准操作协议,以及现有 PDX 模型的特征/实验。
Abstract
累积证据表明,在传统二维组织培养容器中生长的黑色素瘤细胞和人类患者体内的分子和生物特性不同。这是由于黑色素瘤细胞的克隆种群的瓶颈选择,这些细胞可以在没有生理条件的情况下在体外茁壮成长。此外,在二维组织培养中对治疗的反应总体上不能忠实地反映对黑色素瘤患者治疗的反应,大多数临床试验未能显示治疗组合的疗效,体 外。虽然将黑色素瘤细胞异种移植到小鼠体内提供了二维组织培养测定中不存在的生理在体内环境,但用于移植的黑色素瘤细胞已经经历了对可能生长在以下的细胞的瓶颈选择建立细胞系时的二维条件。瓶颈造成的不可逆转的改变包括生长和入侵特性的变化,以及特定亚种群的丧失。因此,更好地概括人体体内状况的模型可以更好地预测有效提高转移性黑色素瘤患者整体存活率的治疗策略。患者衍生的异种移植 (PDX) 技术涉及将肿瘤细胞从人类患者直接植入小鼠受体。通过这种方式,肿瘤细胞在体内的生理压力下不断生长,从不经历二维瓶颈,从而保留肿瘤在人类患者体内时存在的分子和生物特性。值得注意的是,从转移器官部位(即大脑)派生的PDX模型显示类似的转移能力,而PDX模型来自治疗天真的患者和获得治疗耐药性的患者(即BRAF/MEK抑制剂治疗)显示类似的敏感性治疗。
Introduction
临床前模型对于转化癌症研究的所有方面都至关重要,包括疾病特征、发现癌症与正常细胞特有的可操作弱点,以及开发利用有效疗法这些弱点,以增加患者的整体生存。在黑色素瘤领域,数以万计的细胞系模型被大量用于药物筛选,仅我们小组就贡献了4,000个细胞系模型(WMXXX系列)。这些细胞系模型来自黑色素瘤患者与各种形式的皮质黑色素瘤(即,腹腔,尿道和表面扩散)和不同的基因型(即,BRAFV600-突变和神经母细胞瘤RAS病毒肿瘤同源性 |国家资源局Q61R-突变体*),它跨越诊所1,2中存在的疾病谱。
毫不含糊地,在黑色素瘤领域最成功的,有针对性的治疗策略已经出现从1)患者肿瘤的基因组表征识别BRAF突变在+50%的黑色素瘤3和2)临床前调查利用黑色素瘤细胞系模型4.BRAF/MEK抑制剂组合是食品和药物管理局(FDA)批准在2014年用于治疗患者的黑色素瘤窝激活BRAFV600E/K突变,并拥有>75%的响应率5。尽管这种初步的疗效,由于多种内在和后天抵抗机制和肿瘤内异质性,几乎在每种情况下都迅速产生抗药性。不幸的是,细胞系模型在塑料容器的二维培养中生长时,不会重述代表性的生物异质性,当研究人员试图进行实验确定时,这掩盖了它们的临床预测潜力。可能有效的治疗与黑色素瘤6的特定形式或基因型的患者。了解如何最好地模拟患者肿瘤内异质性,使研究人员能够更好地开发治疗模式,可以杀死导致失败到当前护理标准疗法的治疗亚人群。
细胞系模型有限的预测价值最大的是它们最初是如何建立的。当患者肿瘤的单细胞悬浮在二维塑料组织培养血管上生长时,肿瘤克隆景观会发生不可逆转的变化,包括增殖和侵入性潜能的变化,消除特定亚种群,遗传信息的改变7。这些黑色素瘤细胞系模型小鼠的异种移植代表了临床前研究在体内平台中最常用的;然而,该策略也遭受复杂的肿瘤异质性临床观察的不良重述。为了克服这一缺陷,人们越来越有兴趣采用更复杂的黑色素瘤临床前模型,包括PDX模型。PDX模型已经使用了30年,在肺癌患者的开创性研究表明,患者对细胞毒性剂的反应与来自同一患者8的PDX模型的反应是一致。最近,在业界和学术中心,人们一直在推动利用 PDX 模型作为临床前研究的首选工具。PDX模型,由于其优越的重述肿瘤异质性在人类患者,更临床上更相关的使用治疗优化工作比细胞系异种移植9。在黑色素瘤中,有巨大的障碍,使治疗管理先进的疾病10。临床相关的PDX模型已被用来模拟临床阻力和确定治疗策略与临床可用的剂,以治疗治疗抗药性肿瘤11,12。简单地说,这里提出的用于生成PDX模型的协议要求将原发性或转移性黑色素瘤(通过活检或手术收集)的新鲜组织皮下植入NOD/scid/IL2受体空(NSG)小鼠。不同群体在方法方法上有不同的变化;然而,一个基本的核心存在13。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文描述了从原发性肿瘤和转移性肿瘤、核心活检和FN中提取患者组织生成黑色素瘤的PDX模型。当直接移植到NSG小鼠中时,肿瘤具有与患者观察到的相似的形态、基因组和生物特性。在只有少量组织可供研究人员使用的情况下,如 FNA 通常发生的情况,PDX 技术允许肿瘤组织扩展以用于 DNA、RNA 和蛋白质表征,以及用于治疗试验,以允许临床前药物发展。
PDX 移植成功的关键是材料调查?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢威斯塔研究所动物设施、显微镜设施、组织技术设施和研究供应中心。这项研究部分由U54(CA224070-01)、SPORE(CA174523)、P01(CA114046-07)、米里亚姆博士和谢尔登·阿德尔森医学研究基金会以及黑色素瘤研究基金会的赠款资助。
Materials
| 1 M Hepes | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # H0887-100ML | |
| 100x PenStrep | Invitrogen | Cat # 15140163 | |
| 1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) | MED | Cat # MT21-023-CV | |
| 2.5% Trypsin | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # T4549-100ML | 10 mL aliquots stored at –20oC |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # A9418-500G | |
| Chlorhexidine | Fisher Scientific | Cat# 50-118-0313 | |
| Collagenase IV (2,000 u/mL) | Worthington | Cat #4189 | make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1 |
| DMSO | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # C6295-50ML | |
| DNase | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # D4527 | |
| EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) | Merck | Cat # 324626.25 | |
| FBS | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 16000-044 | |
| Fungizone | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 15290-018 | |
| Gentamicin | FISHER SCIENTIFIC | Cat # BW17518Z | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | Cat # 050031 | |
| Leibovitz's L15 media | Invitrogen | Cat # 21083027 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354230 | Artificial extracellular matrix |
| Meloxicam | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein | Cat # 025115 | 1-5mg/kg, as painkiller |
| NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice | The Wistar Institute, animal facility | breeding | |
| PVA (polyvinyl alcohol) | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # P8136-250G | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Fisher Scientific | Cat# MT10041CM | |
| Scalpel | Feather | Cat # 2976-22 | |
| Virkon | GALLARD-SCHLESINGER IND | Cat # 222-01-06 | |
| Wound clips | MikRon | Cat #427631 |
References
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