흑색종 환자 유래 이종이식 모델
Summary
환자 유래 이종이식(PDX) 모델은 흑색종 분자 및 생물학적 특징을 보다 강력하게 회귀하고 기존의 플라스틱 조직 배양 계 세포 에 비해 치료 반응의 더 예측이다. 여기서는 새로운 PDX 모델 의 확립과 기존 PDX 모델의 특성화/실험에 대한 표준 운영 프로토콜에 대해 설명합니다.
Abstract
축적 된 증거는 분자 및 생물학적 특성이 인간 환자에서 생체 내에서 대 전통적인 2 차원 조직 배양 혈관에서 성장 흑색종 세포에서 다르다는 것을 시사한다. 이것은 생리적인 조건의 부재에 있는 시험관에서 강력하게 증가할 수 있는 흑색종 세포의 클론 인구의 병목 현상 선택 때문입니다. 또한, 2차원 조직 배양에서의 치료에 대한 반응은 전체적으로 흑색종 환자의 치료에 대한 반응을 충실하게 반영하지 못하며, 대부분의 임상 시험에서 치료 조합의 효능을 보여주지 못하는 것으로 나타났다. 체 외. 마우스로 흑색종 세포의 이종이식은 2차원 조직 배양 실험에서 결석한 생체내 문맥을 제공하지만, 생착에 사용되는 흑색종 세포는 이미 밑에 성장할 수 있는 세포를 위한 병목 현상 선택을 겪었습니다 세포주가 확립되었을 때 2차원 조건. 병목 현상의 결과로 발생하는 돌이킬 수없는 변경은 성장 및 침략 특성의 변화뿐만 아니라 특정 하위 집단의 손실을 포함합니다. 따라서 생체 내에서 인간의 상태를 더 잘 재현하는 모델은 전이성 흑색종을 가진 환자의 전반적인 생존을 효과적으로 증가시키는 치료 전략을 더 잘 예측할 수 있다. 환자 유래 이종이식(PDX) 기술은 인간 환자로부터 마우스 수용자로 종양 세포를 직접 이식하는 것을 수반한다. 이러한 방식으로, 종양 세포는 생체 내에서 생리적 스트레스 하에서 일관되게 성장하며, 종양이 인간 환자에 있을 때 존재하는 분자 및 생물학적 특성을 보존하는 2차원 병목 현상을 겪지 않습니다. 주목할만한, 전이의 장기 사이트에서 파생 된 PDX 모델 (즉, 뇌) 유사한 전이 용량을 표시, 치료 순진한 환자와 치료에 후천성 저항 환자에서 파생 된 PDX 모델 동안 (즉, BRAF / MEK 억제제 치료) 디스플레이 치료에 유사한 감도.
Introduction
전임상 모델은 질병 특성화, 암과 정상 세포에 고유한 실행 가능한 취약성 발견, 악용하는 효과적인 치료법 의 개발을 포함한 번역암 연구의 모든 측면에 매우 중요합니다. 환자의 전반적인 생존을 증가시키기 위해 이러한 취약점. 흑색종 필드에서, 수만개의 세포주 모형은 약 검열을 위해 무겁게 이용되었습니다, 와 함께 >4,000 혼자 우리 단에 의해 기여했습니다 (WMXXX 시리즈). 이러한 세포주 모델은 다양한 형태의 종족 흑색종(즉, 아크랄, 포벨 및 피상적 확산) 및 다양한 유전자형(즉, BRAFV600-돌연변이 체종 및 신경아세포종 RAS 바이러스 성 종양유전자)을 가진 흑색종 환자로부터 유래되었다. NRA Q61R-돌연변이]), 이는 클리닉1,2에존재하는 질병의 스펙트럼에 걸쳐.
명백하게, 흑색종 필드에 있는 가장 성공적인, 표적으로 한 치료 전략은 1) 흑색종의 ~50%에서 BRAF 돌연변이를 확인하는 환자의 종양의 게놈 특성에서 나타났습니다3 그리고 2) 전임상 조사에서 흑색종 세포주 모델을활용 4. BRAF/MEK 억제제 조합은 2014년 미국 식품의약국(FDA)에서 BRAF V600E/K 돌연변이를 활성화시키는 흑색종 항적 환자의 치료를 위해 승인되었으며>75% 응답률5를자랑한다. 이 초기 효험에도 불구하고, 저항은 다방면의 본질적이고 취득한 저항 기계장치 및 종양 내 이질성 때문에 거의 모든 경우에 급속하게 생깁니다. 불행히도, 세포주 모델은 플라스틱 용기에서 2차원 배양으로 재배될 때 대표적인 생물학적 이질성을 되풀이하지 않으며, 이는 조사자가 실험적으로 결정하려고 할 때 임상적으로 예측 잠재력을 가리는 것입니다. 흑색종의 특정 양식 또는 유전자형을 가진 환자에서 효과적일 지도 모르다 치료6. 환자를 가장 잘 모델링하는 방법을 이해하면 조사자가 현재 의 치료 표준 치료에 실패를 유도하는 치료 저항하는 하위 집단을 죽일 수 있는 치료 양식이 더 잘 개발될 수 있습니다.
세포주 모델의 제한된 예측 값에 가장 중요한 것은 세포주 모델이 처음 확립되는 방식입니다. 환자의 종양의 단세포 현탁액이 증식 및 침습적 잠재력의 변화를 포함하여 2 차원, 플라스틱 조직 배양 혈관에서 성장할 때 돌이킬 수없는 변화는 종양 클론 풍경에서 발생하며, 특정의 제거 유전 정보의 변경7. 이러한 흑색종 세포주 모델의 마우스로의 이종이식은 전임상 연구를 위해 생체내에서 가장 빈번히 사용되는 것을 나타낸다; 그러나, 이 전략은 또한 임상적으로 관찰된 복잡한 종양 이질성의 가난한 재발로부터 고통받고 있다. 이 결점극복하기 위하여는, PDX 모형을 포함하여 흑색종의 더 정교한 전임상 모형을 통합에 있는 증가관심사가 증가하고 있습니다. PDX 모델은 30년 동안 활용되어 왔으며, 폐암 환자에서 세포독성 제제에 대한 환자의 반응과 동일한 환자로부터 유래된 PDX 모델의 반응사이의 일치를 입증하는 정액 연구와 함께 8. 최근에는 PDX 모델을 업계와 학술 센터 모두에서 전임상 조사를 위한 도구로 활용하려는 드라이브가 있었습니다. PDX 모델은 인간 환자에서 종양 이질성의 우수한 재항복 때문에, 세포주 이종이식9보다 치료 최적화 노력에 보다 임상적으로관련이 있다. 흑색종에서는, 향상된 질병10의치료 관리를 무디게 하는 거대한 장애물이 있습니다. 임상적으로 관련있는 PDX 모델은 임상 내성을 모델링하고 치료 내성 종양을 치료하기 위해 임상적으로 이용 가능한 제제와 치료 전략을 식별하는 데 사용되어 왔다11,12. 간단히, PDX 모델을 생성하기 위해 여기에 제시된 프로토콜은 NOD/scid/IL2 수용체 널(NSG) 마우스로 1차 또는 전이성 흑색종(생검 또는 수술에 의해 수집)으로부터 신선한 조직의 피하 이식을 요구한다. 방법론적 접근법의 다른 변형은 다른 그룹에서 사용됩니다. 그러나 기본 핵심은13.
Protocol
Representative Results
Discussion
본원에서 원발성 및 전이성 종양, 핵심 생검 및 FNA로부터 유래된 환자 조직을 가진 흑색종의 PDX 모델을 생성하는 것을 기술했다. NSG 마우스로 직접 이식될 때, 종양은 환자에서 관찰된 것과 유사한 형태학적, 게놈 및 생물학적 특성을 제시한다. 소수의 조직만 조사자가 사용할 수 있는 경우, 종종 FNA에서 발생하는 것처럼 PDX 기술은 DNA, RNA 및 단백질 특성화를 위한 종양 조직의 확장뿐만 아니라 전?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 위스타 연구소 동물 시설, 현미경 검사시설, 조직 기술 시설 및 연구 공급 센터에 감사드립니다. 이 연구는 U54 (CA224070-01), SPORE (CA174523), P01 (CA114046-07), 미리암 박사와 셸던 G. 아델슨 의학 연구 재단, 그리고 흑색종 연구 재단의 보조금에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| 1 M Hepes | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # H0887-100ML | |
| 100x PenStrep | Invitrogen | Cat # 15140163 | |
| 1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) | MED | Cat # MT21-023-CV | |
| 2.5% Trypsin | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # T4549-100ML | 10 mL aliquots stored at –20oC |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # A9418-500G | |
| Chlorhexidine | Fisher Scientific | Cat# 50-118-0313 | |
| Collagenase IV (2,000 u/mL) | Worthington | Cat #4189 | make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1 |
| DMSO | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # C6295-50ML | |
| DNase | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # D4527 | |
| EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) | Merck | Cat # 324626.25 | |
| FBS | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 16000-044 | |
| Fungizone | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 15290-018 | |
| Gentamicin | FISHER SCIENTIFIC | Cat # BW17518Z | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | Cat # 050031 | |
| Leibovitz's L15 media | Invitrogen | Cat # 21083027 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354230 | Artificial extracellular matrix |
| Meloxicam | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein | Cat # 025115 | 1-5mg/kg, as painkiller |
| NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice | The Wistar Institute, animal facility | breeding | |
| PVA (polyvinyl alcohol) | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # P8136-250G | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Fisher Scientific | Cat# MT10041CM | |
| Scalpel | Feather | Cat # 2976-22 | |
| Virkon | GALLARD-SCHLESINGER IND | Cat # 222-01-06 | |
| Wound clips | MikRon | Cat #427631 |
References
- Garman, B., et al. Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
- Paraiso, K. H., et al. Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy. British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).
- Long, G. V., et al. Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib. Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).
- Shi, H., et al. Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy. Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).
- Monsma, D. J., et al. Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms. American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Recherche en cancérologie. 77 (21), 62-66 (2017).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- De La Rochere, P., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).
