黒色腫患者由来異種移植片モデル
Summary
患者由来異種移植片(PDX)は、黒色腫の分子および生物学的特徴をより強固に要約し、従来のプラスチック組織培養ベースのアッセイと比較して治療応答のより予測的である。ここでは、新しいPDXモデルの確立と既存のPDXモデルの特性/実験のための標準的な動作プロトコルについて説明します。
Abstract
蓄積された証拠は、従来の2次元組織培養容器で増殖した黒色腫細胞とヒト患者の生体内での分子および生物学的特性が異なっていることを示唆している。これは、生理学的条件がない場合にインビトロで強く成長することができる黒色腫細胞のクローン集団のボトルネック選択によるものです。さらに、2次元組織培養における治療に対する反応は、全体的に黒色腫患者における治療に対する反応を忠実に反映しておらず、臨床試験の大半は治療的組み合わせの有効性を示すことができなかった。Vitro。マウスへの黒色腫細胞の異種移植は、2次元組織培養アッセイに欠ける生体内の生理的な文脈を提供するが、生体細胞は、移植に使用される細胞のボトルネック選択を既に受けている。細胞株が確立された時の2次元条件。ボトルネックの結果として発生する不可逆的な変更には、成長および侵入特性の変化、および特定の亜集団の損失が含まれます。したがって、生体内のヒトの状態をより良く要約するモデルは、転移性黒色腫患者の全体的な生存率を効果的に増加させる治療戦略をより良く予測することができる。患者由来異種移植片(PDX)技術は、ヒト患者からマウスレシピエントへの腫瘍細胞の直接移植を含む。このようにして、腫瘍細胞は生体内の生理的ストレスの下で一貫して成長し、腫瘍がヒト患者にあったときに存在する分子および生物学的特性を維持する2次元ボトルネックを受けることはありません。注目すべきは、転移の臓器部位(すなわち、脳)に由来するPDXモデルは同様の転移能を示し、一方、PDXモデルは治療に対する素朴な患者および治療に対する後天性抵抗性を有する患者(すなわち、BRAF/MEK阻害剤療法)に由来する。治療と同様の感受性。
Introduction
前臨床モデルは、疾患の特徴付け、癌と正常細胞に特有の実行可能な脆弱性の発見、および悪用する有効な治療法の開発を含む、翻訳癌研究のすべての側面において重要である。これらの脆弱性は、患者の全体的な生存率を高めるために.黒色腫分野では、何万もの細胞株モデルが薬物スクリーニングに多く利用されており、グループだけでも4,000人が貢献しています(WMXXXシリーズ)。これらの細胞株モデルは、様々な形態の皮膚黒色腫(すなわち、皮膚、腹部、表在性広がりを有する黒色腫患者)および多様な遺伝子型(すなわち、BRAF V600-変異および神経芽細胞腫RASウイルス腫瘍遺伝子ホモロ) に由来した。NRASQ61R-変異体])、これは、診療所1、2に存在する疾患のスペクトルにまたがる。
明らかに、黒色腫分野における最も成功した標的治療戦略は、1)黒色腫3の約50%でBRAF変異を同定する患者の腫瘍のゲノム特性を明らかにし、2)前臨床調査から出現した。黒色腫細胞株モデル4を活用する。BRAF/MEK阻害剤の組み合わせは、黒色腫がBRAFV600E/K変異を活性化し、>75%の応答率5を誇る患者の治療のために2014年に承認された食品医薬品局(FDA)でした。この初期の有効性にもかかわらず、多重固有および獲得した抵抗機構および腫瘍内不均一性のために、ほぼすべてのケースで抵抗が急速に生じる。残念ながら、細胞株モデルは、プラスチック容器内の2次元培養中に成長した場合の代表的な生物学的不均一性を要約しない。黒色腫6の特定の形態または遺伝子型を有する患者に有効であるかもしれない療法。腫瘍内不均一性を最適にモデル化する方法を理解することは、研究者が現在の標準的なケア療法に失敗を駆動する治療耐性の亜集団を殺すことができる治療モダリティをより良く開発することを可能にします。
セルラインモデルの限られた予測値に最も重要なのは、それらが最初にどのように確立されるかです。患者の腫瘍の単細胞懸濁液が2次元のプラスチック組織培養血管上で増殖すると、腫瘍クローンの景観において不可逆的な変化が起こり、増殖性および侵襲性の変化を含む、特異的な排除亜集団、および遺伝情報の改変7.これらの黒色腫細胞株モデルのマウスへの異種移植片は、前臨床試験のための生体内プラットフォームで最も頻繁に使用される。しかし、この戦略はまた、臨床的に観察される複雑な腫瘍の不均一性の貧弱な要約に苦しんでいる。この欠点を克服するために、PDXモデルを含む、より洗練された前臨床モデルの黒色腫を組み込むことに関心が高まっています。PDXモデルは>30年にわたり利用されており、肺癌患者における精液研究は、細胞傷害性薬剤に対する患者の応答と同じ患者8由来のPDXモデルの応答との間の一致を実証した。近年、PDXモデルを業界や学術センターの前臨床調査に最適なツールとして活用する動きが見られます。PDXモデルは、ヒト患者における腫瘍の不均一性の優れた要約のために、細胞株異種移植片9よりも治療最適化の取り組みにおいて使用することにより臨床的に関連している。黒色腫では、高度疾患10の治療管理を鈍らせる巨大なハードルがある。臨床的に関連するPDXモデルは、臨床的耐性をモデル化し、治療抵抗性腫瘍11、12を治療するために臨床的に利用可能な薬剤を用いて治療戦略を同定するために使用されてきた。簡単に言えば、PDXモデルを生成するためにここに提示されたプロトコルは、NOD/scid/IL2受容体ヌル(NSG)マウスへの原発性または転移性黒色腫(生検または手術によって収集される)からの新鮮な組織の皮下移植を必要とする。方法論的アプローチの異なるバリエーションは、異なるグループによって使用されます。ただし、基本的なコアは13が存在します。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、原発性および転移性腫瘍、コア生検、およびFNAに由来する患者組織を有する黒色腫のPDXモデルの生成について説明した。NSGマウスに直接移植されると、腫瘍は患者で観察されるものと同様の形態学的、ゲノム的、および生物学的特性を有する。FNAで頻繁に発生する少量の組織しか研究者が利用できない場合、PDX技術はDNA、RNA、タンパク質の特性特性に対する腫瘍組織の拡大を可能に?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ウィスター研究所動物施設、顕微鏡検査施設、ヒストテクノロジー施設、研究サプライセンターに感謝しています。この研究は、U54(CA224070-01)、SPORE(CA174523)、P01(CA114046-07)、ミリアム博士とシェルドン・G・アデルソン医学研究財団、メラノーマ研究財団からの助成金の一部を受け取りました。
Materials
| 1 M Hepes | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # H0887-100ML | |
| 100x PenStrep | Invitrogen | Cat # 15140163 | |
| 1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) | MED | Cat # MT21-023-CV | |
| 2.5% Trypsin | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # T4549-100ML | 10 mL aliquots stored at –20oC |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # A9418-500G | |
| Chlorhexidine | Fisher Scientific | Cat# 50-118-0313 | |
| Collagenase IV (2,000 u/mL) | Worthington | Cat #4189 | make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1 |
| DMSO | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # C6295-50ML | |
| DNase | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # D4527 | |
| EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) | Merck | Cat # 324626.25 | |
| FBS | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 16000-044 | |
| Fungizone | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 15290-018 | |
| Gentamicin | FISHER SCIENTIFIC | Cat # BW17518Z | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | Cat # 050031 | |
| Leibovitz's L15 media | Invitrogen | Cat # 21083027 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354230 | Artificial extracellular matrix |
| Meloxicam | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein | Cat # 025115 | 1-5mg/kg, as painkiller |
| NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice | The Wistar Institute, animal facility | breeding | |
| PVA (polyvinyl alcohol) | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # P8136-250G | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Fisher Scientific | Cat# MT10041CM | |
| Scalpel | Feather | Cat # 2976-22 | |
| Virkon | GALLARD-SCHLESINGER IND | Cat # 222-01-06 | |
| Wound clips | MikRon | Cat #427631 |
References
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