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Biochimie

細菌病原体脂肪酸を膜リン脂質に取り込む研究のための鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の単離

Published: May 15, 2019
doi:
10.3791/59538
, ,
1Department of Microbiology and Molecular Genetics,Michigan State University, 2Department of Physiology,Michigan State University

Summary

この方法は、複雑な宿主源から細菌膜、特に黄色ブドウ球菌に外因性脂肪酸を取り込む研究のためのフレームワークを提供する。これを達成するために、鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の濃縮のためのプロトコルと、質量分析を利用した細菌リン脂質のその後の脂肪酸プロファイリングについて説明する。

Abstract

黄色ブドウ球菌および他のグラム陽性病原体は、環境からの脂肪酸を膜リン脂質に組み込む。感染中、外因性脂肪酸の大部分は宿主リポタンパク質粒子内に存在する。宿主脂肪酸の貯蔵所や、細菌がリポタンパク質粒子から脂肪酸を抽出するメカニズムに関しては、不確実性が残っている。本研究では、鶏卵黄からの低密度リポタンパク質(LDL)粒子を濃縮し、LDLがS.アウレウスの脂肪酸貯留槽として機能するかどうかを決定するためのプロトコルについて説明する。この方法は、LLLと細菌間の相互作用を探索するための効果的かつ経済的なモデルである、公平なリピドミック分析と鶏LLLを利用する。LDLからの外因性脂肪酸のS.aureus統合の解析は、高解像度/正確な質量分析とタンデム質量分析を用いて行われ、細菌の脂肪酸組成の特性評価を可能にする。LLLへの曝露時に細菌膜脂質に生じる脂肪酸の新しい組み合わせの膜および公平な同定。これらの高度な質量分析技術は、リン脂質に組み込まれた特定の外因性脂肪酸を明らかにすることによって、脂肪酸の組み込みの比類のない視点を提供します。ここで概説する方法は、他の細菌病原体および複合脂肪酸の代替供給源の研究に適応可能である。

Introduction

メチシリン耐性S.アウレウス(MRSA)は、ヘルスケア関連感染の主な原因であり、関連する抗生物質耐性はかなりの臨床的課題である1、2、3である。したがって、新規治療戦略の開発は最優先事項である。グラム陽性病原体の有望な治療戦略は、脂肪酸合成を阻害しており、S.アウレウスにおいて、ホスファチジルグリセロール(PG)、リシル-PG、およびカージリピン4を含むリン脂質産生の要件である。細菌では、脂肪酸合成II経路(FASII)5を介して脂肪酸産生が起こり、真核生物とはかなり異なり、FASIIは抗生物質開発の魅力的な標的となる5,6.FASII阻害剤は、主にFabIを標的とし、脂肪酸炭素鎖伸びに必要な酵素7.FabI阻害剤トリクロサンは、広く消費財や医療用品8、9で使用されています。追加のFabI阻害剤は、S.アウレウス感染症10、11、12、13、14の治療のためにいくつかの製薬会社によって開発されています ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26.しかしながら、S.aureusを含む多くのグラム陽性病原体は、リン脂質合成のための外因性脂肪酸を清掃し、FASII阻害27、28、29をバイパスすることができる。したがって、FASII阻害剤の臨床的可能性は、宿主脂肪酸の供給源と病原体が宿主27、28から脂肪酸を抽出するメカニズムに関する我々の知識のかなりのギャップのために議論される。これらのギャップに対処するために、リポタンパク質粒子からS.aureusの膜リン脂質への外因性脂肪酸の取り込みを監視する偏りのないリピドミック分析法を開発した。

敗血症の間、宿主リポタンパク質粒子は血管内の宿主由来脂肪酸の潜在的な供給源を表し、宿主脂肪酸の大部分は粒子30に関連している。リポタンパク質は、リン脂質およびタンパク質からなる親水性シェルからなるもので、トリグリセリドおよびコレステロールエステル31の疎水性コアを囲む。シロミクロン、非常に密度の高いリポタンパク質、高密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質(LDL)の4つの主要なクラスは、ホストによって生成され、脂質輸送手段として機能し、脂肪酸とコレステロールを送達します。血管系を介して細胞をホストします。LLLは、トリグリセリドおよびコレステロールエステル31を含むエステル化脂肪酸に豊富である。我々は、高度に精製されたヒトLLLがPG合成のための外因性脂肪酸の生存可能な供給源であることを以前に実証し、したがってFASII阻害剤バイパス32のメカニズムを提供する。精製ヒトLLLの浄化は技術的に困難で時間がかかる一方で、精製されたヒトLLLの商業的供給源は日常的に使用したり、大規模な細菌スクリーンを実行するために非常に高価です。これらの制限に対処するために、我々は、リポタンパク質粒子33の豊富な供給源である鶏卵黄からのLLLの濃縮のための手順を修正した。我々は、S.aureus32の膜へのヒトLDL由来脂肪酸の取り込みを監視するために、標的とされていない、高解像度/正確な質量分析とタンデム質量分析を使用することに成功しました。以前に報告された方法とは異なり、このアプローチは、3つの主要なブドウ球菌リン脂質タイプのそれぞれについて個々の脂肪酸異性体を定量することができる。オレイン酸(18:1)は、S.アウレウスリン脂質29、30、32に容易に組み込まれるすべての宿主リポタンパク質粒子内に存在する不飽和脂肪酸である。S.アウレウスはオレイン酸合成29ができない。従って、リン脂質組み込みオレイン酸の量は、ブドウ球菌膜29内の宿主リポタンパク質由来脂肪酸の存在を確立する。これらのリン脂質種は、ここで説明する最先端の質量分析法によって同定することができ、脂肪酸源の存在下で培養されたS.aureusの膜組成の前例のない分解能を提供する可能性が高い感染中に遭遇する。

Protocol

注:鶏卵黄からのLDL粒子の濃縮のための以下のプロトコルは、Moussaら200233に由来する。 1. LDL粒子濃縮用鶏卵黄の調製 70%のエタノール溶液で殻を洗って2つの大きな鶏卵を消毒し、空気乾燥を可能にします。 70%のエタノール溶液を使用して卵分離器を消毒し、空気乾燥を可能にします。中型ビーカーの唇に卵セパレータを取り付けます。…

Representative Results

鶏卵黄からのLDLの濃縮のためのプロトコルを図1に示す。このプロセスは、全卵黄を生理食で希釈し、顆粒と呼ばれる卵黄固体をLLLを含む可溶性または血漿分画から分離することから始まる(図1)33。血漿画分のLDL含有量は、〜30〜40kDaβ-ライブチン(図2)33の沈殿によってさらに濃縮され?…

Discussion

S.アウレウスは、その膜リン脂質27、32、43に外因性脂肪酸を組み込む。外因性脂肪酸を用いるリン脂質合成は、FASII阻害をバイパスするが、膜27、32、44の生体物理学的特性も変化する。グラム陽性病原体のリン脂質への外因性脂肪酸の取り込みは?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、この作品の原稿とサポートの彼らの批判的な評価のためにハンマー研究室のメンバーに感謝します。コロラド大学医学部のアレックス・ホースウィル博士はAH1263を親切に提供しました。ミシガン州立大学のクリス・ウォーターズ博士の研究室は試薬を提供しました。この研究は、アメリカ心臓協会の助成金16SDG30170026とミシガン州立大学が提供するスタートアップ資金によって支援されました。

Materials

Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6×250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific
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Keywords: Lipoprotein ParticlesChicken Egg YolkBacterial PathogenFatty Acid IncorporationMembrane PhospholipidsLipidomic AnalysisStaphylococcus AureusAmmonium SulfateDialysis
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Citer Cet Article
Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).
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