JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

Membran fosfolipidler içine bakteriyel patojen yağ asidi kuruluş çalışması için tavuk yumurtası sarısı lipoprotein parçacıklarının yalıtım

Published: May 15, 2019
doi:
10.3791/59538
, ,
1Department of Microbiology and Molecular Genetics,Michigan State University, 2Department of Physiology,Michigan State University

Summary

Bu yöntem, özellikle Staphylococcus aureusgibi kompleks ana kaynaklardan gelen eksojen yağ asitleri dahil etmek için bir çerçeve sağlar. Bunu başarmak için, tavuk yumurtası sarısı ve kütle spektrometresi kullanan bakteriyel fosfolipidlerin sonraki yağ asidi profillerinden lipoprotein parçacıklarının zenginleşmesi için protokoller açıklanmıştır.

Abstract

Staphylococcus aureus ve diğer gram-pozitif patojenler, çevreye gelen yağ asitleri membranlı fosfolipidlere dahil ederler. Enfeksiyon sırasında, eksojen yağ asitleri çoğunluğu ana lipoprotein parçacıkları içinde mevcut. Belirsizlik, ana yağ asitleri rezervuarında ve bakterilerin lipoprotein parçacıklarından yağ asitleri özü olan mekanizmalar olarak kalır. Bu çalışmanın içinde, tavuk yumurtası sarısı ile düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) parçacıklarının zenginleşmesi ve LDL ‘Lerin S. aureusiçin yağ asidi rezervuarları olarak hizmet edip etmediğini belirlemek için protokoller açıklanmaktadır. Bu yöntem, tarafsız lipidomik analiz ve tavuk Ldıs, Ldıs ve bakteriler arasındaki etkileşimlerin keşfi için etkili ve ekonomik bir model istismar. LDL ‘lerden eksojen yağ asitleri S. aureus entegrasyonu Analizi yüksek çözünürlüklü/doğru kütle spektrometresi ve tandem kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilir, bakteriyel yağ asidi bileşiminin karakterizasyonu sağlayan membran ve Ldıs maruz kaldıktan sonra bakteriyel membran lipidlerde ortaya çıkan yağ asitleri yeni kombinasyonları tarafsız tanımlaması. Bu gelişmiş kütle spektrometresi teknikleri, fosfolipidlere dahil edilen özel eksojen yağ asitlerini açığa çıkararak yağ asidi birleştirmesi için eşsiz bir perspektif sunar. Burada özetlenen Yöntemler diğer bakteriyel patojenlerin incelenmesi ve karmaşık yağ asitleri alternatif kaynaklarının uyarlanabilir.

Introduction

Metikiline dayanıklı S. aureus (MRSA) sağlık bağlantılı enfeksiyonun önde gelen nedenidir ve ilişkili antibiyotik direnci önemli bir klinik zorluk1,2,3. Bu nedenle, yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesi yüksek önceliktir. Gram-pozitif patojenler için umut verici bir tedavi stratejisi yağ asidi sentezini inhibe ediyor, S. aureus‘ta fosfatidilgliserin (PG), lysyl-PG ve kardiyolipin4içeren membran fosfolipid üretiminin bir gereksinimi. Bakterilerde, yağ asidi üretimi yağ asidi sentezi II yolu (fasii)5ile gerçekleşir, bu da ökaryotik mevkidaşı ‘ndan önemli ölçüde farklıdır, antibiyotik gelişimi için fasii ‘ye cazip bir hedef haline gelir5,6 . FASıı inhibitörleri öncelikle FabI hedef, yağ asidi karbon zincir uzaması için gerekli bir enzim7. Fabi inhibitörü triklosan, tüketici ve tıbbi malların8,9‘ da geniş çapta kullanılmaktadır. Ek Fabi inhibitörleri S. aureus enfeksiyonu tedavisi için çeşitli ilaç şirketleri tarafından geliştirilmiştir10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Ancak, S. aureusdahil olmak üzere birçok gram-pozitif patojenler, fosfolipid sentezi için eksojen yağ asitleri atma yeteneğine sahiptir, fasii inhibisyonu bypass27,28,29. Bu nedenle, fasii inhibitörlerinin klinik potansiyeli, ana yağ asitleri kaynaklarının bilgilerimizde önemli boşluklar ve patojenler,27,28ana gelen yağ asitleri ayıklamak mekanizmaları nedeniyle tartışılır. Bu boşlukları ele almak için, lipoprotein parçacıklarından S. aureusmembran fosfolipidlerine kadar eksojen yağ asidin birleştirildiğini izlemek için tarafsız bir lipidomik analiz yöntemi geliştirdik.

Sepsis sırasında, ana yağ asitleri çoğunluğu parçacıklar30ile ilişkili olarak ev sahibi lipoprotein parçacıkları damar içinde ev sahibi türetilmiş yağ asitleri potansiyel bir kaynak temsil eder. Lipoproteinler, trigliserid ve kolesterol esterlerinin hidrofobik çekirdeğini kapsayan fosfolipidler ve proteinlerden oluşan hidrofilik bir kabuk oluşur31. Lipoproteinleri dört ana sınıfları–chylomicron, çok düşük yoğunluklu lipoprotein, yüksek yoğunluklu lipoprotein, ve düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL)-, lipid taşıma araçları olarak ev sahibi ve fonksiyon tarafından üretilen yağ asitleri ve kolesterol teslim ve hücreleri damar üzerinden barındırabilir. LDLs trigliserid ve kolesterol esterleri de dahil olmak üzere esterleşmiş yağ asidi bol31. Daha önce son derece saflaştırılmış insan Ldıs PG sentezi için eksojen yağ asitleri uygun bir kaynak olduğunu göstermiştir, böylece FASıı inhibitörü bypass32için bir mekanizma sağlar. İnsan LDL ‘Leri arındırmak, teknik olarak zorlu ve zaman alıcı olabilir, çünkü saflaştırılmış insan LDL ‘lerin ticari kaynakları rutin olarak kullanmak veya büyük ölçekli bakteriyel ekranlar gerçekleştirmek için yasak şekilde pahalıdır. Bu sınırlamaları gidermek için, biz tavuk yumurta sarısı, lipoprotein parçacıkları33zengin bir kaynak ldls zenginleştirme için bir prosedür değiştirildi. İnsan LDL türevi yağ asitlerinin S. aureus32membranı içine eklenmesi için hedefsiz, yüksek çözünürlüklü/doğru kütle spektrometresi ve tandem kütle spektrometresi başarıyla kullandık. Daha önce bildirilen yöntemlerden farklı olarak, bu yaklaşım üç büyük stafilokok fosfolipid türünün her biri için bireysel yağ asidi izomerleri ölçebilir. Oleik asit (18:1) S. aureus fosfolipidler29,30,32içine kolayca dahil tüm ev sahibi lipoprotein parçacıkları içinde mevcut doymamış bir yağ asidi. S. aureus oleik asit sentezi29yeteneğine sahip değildir; Bu nedenle, fosfolipid-Incorporated oleik asit miktarı stafilokok membran içinde Host lipoprotein türetilmiş yağ asitleri varlığı kurar29. Bu fosfolipid türler, burada açıklanan State-of-the-art kitle spektrometresi yöntemi ile tespit edilebilir, bir yağ asidi kaynağının varlığında S. aureus küllik eşsiz çözünürlüğü sunan büyük olasılıkla enfeksiyon sırasında karşılaşır.

Protocol

Not: tavuk yumurtası sarısı gelen LDL partiküllerin zenginleştirme için aşağıdaki protokol Moussa ve al. 200233. 1. LDL parçacıklarının zenginleşmesi için tavuk yumurtası sarısı hazırlanması 70% etanol çözeltisi ile kabukları yıkayarak iki büyük tavuk yumurtası sanitize ve kuru hava sağlar. % 70 etanol çözeltisi kullanarak yumurta ayırıcı sanitize ve kuru hava sağlar. Yumurta ayırıcı orta ölçekli bir Beaker duda…

Representative Results

Tavuk yumurtası sarısı tarafından LDL zenginleştirme Protokolü Şekil 1′ de gösterilmiştir. Bu işlem, tüm yumurta sarısı ile tuz seyreltilerek başlar ve yumurta sarısı katıları ayrıştırmadan veya plazma kesir Ldıs içeren granül olarak adlandırılan ayıran (Şekil 1)33. Plazma fraksiyonu LDL içeriği daha fazla yağış ile zenginleştirilmiştir ~ 30-40 kDa β-livetins (<strong cl…

Discussion

S. aureus membran fosfolipidlerin içine eksojen yağ asitleri birleştirir27,32,43. Eksojen yağ asitleri kullanarak fosfolipid sentezi fasii inhibisyonu atlar ama aynı zamanda membranın Biyofizik özelliklerini değiştirir27,32,44. Gram-pozitif patojenlerin fosfolipidlerine eksojen yağ asitleri eklenmesi iyi belgelenmiş …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz bu işin el yazması ve destek kritik değerlendirme için Hammer laboratuar üyelerine teşekkür ederiz. Dr Alex Horswill üniversite Colorado Okulu tıp nazik AH1263 sağladı. Dr. Chris Waters laboratuar Michigan State Üniversitesi reaktifler sağladı. Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği Grant 16, 30170026 ve başlangıç fonları Michigan State Üniversitesi tarafından sağlanan tarafından desteklenmektedir.

Materials

Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6×250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
  3. Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
  4. Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
  5. Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
  6. Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
  8. Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
  9. Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
  10. Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
  11. Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
  12. Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
  13. Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
  14. Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
  15. Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
  16. Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
  17. Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
  18. Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
  19. Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
  20. Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
  21. Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
  22. Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
  23. Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
  24. Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
  25. Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
  26. Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
  27. Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
  28. Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
  29. Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
  30. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
  31. Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
  32. Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
  33. Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
  34. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
  35. Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
  36. Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
  37. Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
  38. Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
  39. Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
  40. Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
  41. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
  42. Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
  43. Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
  44. Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
  45. Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
  46. Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
  47. Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
  48. Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts – Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
  49. Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
  50. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).

Tags

Keywords: Lipoprotein ParticlesChicken Egg YolkBacterial PathogenFatty Acid IncorporationMembrane PhospholipidsLipidomic AnalysisStaphylococcus AureusAmmonium SulfateDialysis
check_url/fr/59538?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image