Summary
我们成功地转换了标准端粒重复扩增协议 (TRAP) 检测, 用于液滴数字聚合酶链反应。这种新的检测方法称为 ddTRAP, 更灵敏、更定量, 可以更好地检测和统计各种人体细胞内端粒酶活性。
Abstract
端粒重复扩增协议 (TRAP) 是检测给定样品中端粒酶活性的最广泛使用的检测方法。基于聚合酶链反应 (PCR) 的方法可以对大多数细胞裂解物的酶活性进行可靠的测量。具有荧光标记引物的凝胶为基的 trap 限制了样品的吞吐量, 检测样品差异的能力被限制为酶活性的两倍或更大的变化。液滴数字 TRAP, ddTRAP, 是一种高度敏感的方法, 已从传统的 TRAP 分析进行了改进, 使用户能够对每次运行的96个样本进行可靠的分析, 并获得 DNA (端粒酶延伸产品) 的绝对定量) 在每个 PCR 中输入。因此, 新开发的 ddTRAP 检测克服了传统的基于凝胶的 trap 检测方法的局限性, 为在实验室和临床环境中测量端粒酶活性提供了更有效、更准确和更定量的方法。
Introduction
端粒是线性染色体末端的动态 dna-蛋白质复合物。人类端粒由 5 '-ttagggn六角重复量组成, 其长度在出生时的长度为12–15千基 (kb) 1。人类端粒酶, 维持端粒的核糖核酸酶, 首次被鉴定在 HeLa 细胞裂解物 (癌细胞系)2中。端粒和端粒酶共同在基因组保护、基因调控和癌细胞死亡 3、4、5、6等一系列生物过程中发挥着重要作用。
人端粒酶主要由两个关键成分组成, 即端粒酶逆转录酶和端粒酶 RNA (分别为 hTERT 和 HTERT)。蛋白质亚基 hTERT 是端粒酶的催化活性逆转录酶成分。RNA 模板 hTERC 为端粒酶提供了扩展和/或维持端粒的模板。大多数人体组织没有可检测到的端粒酶活性。DNA 聚合酶无法扩展 DNA 滞后链的末端, 以及端粒酶的缺乏, 导致端粒在每轮细胞分裂后逐渐缩短。这些现象导致端粒缩短在大多数体细胞, 直到他们达到一个临界缩短的长度, 从而细胞进入复制衰老的状态。细胞的最大分裂次数是由其端粒长度决定的, 而这种细胞持续分裂被认为是为了防止进展到发生 7.癌细胞能够克服端粒诱导的复制衰老, 并通过利用端粒酶维持端粒继续增殖。大约90% 的癌症激活端粒酶, 使端粒酶活性在癌症检测和治疗中至关重要。
1990年代的发展有助于确定端粒酶的必要成分, 并用于测量各种正常和癌变的细胞和组织中的端粒酶。最初的基于凝胶的 PCR 检测方法使用放射性标记的 DNA 底物来检测端粒酶活性。2006年, 该方法被采用荧光标记的基板8,9进行了改编成非放射性形式。通过使用荧光标记的基板, 用户能够将端粒酶扩展产品可视化为凝胶上的条带, 使其暴露在正确的激发波长下。TRAP 检测方法的灵敏度及其检测粗细胞裂解物端粒酶活性的能力使其成为最广泛使用的端粒酶活性检测方法。然而, TRAP 检测有局限性。该分析是基于凝胶的, 因此很难在中等至高通量的研究中进行必要的复制, 因此, 很少进行适当的统计分析。此外, 基于凝胶的检测很难可靠地量化, 因为无法检测到样本间端粒酶活性的不到两倍的差异。克服这两个限制对于酶活性检测 (如 TRAP) 转移到临床或行业环境以检测患者样本或药物设计研究中的端粒酶活性至关重要。
数字 PCR 最初是在1999年开发的, 作为将 PCR 的指数和模拟性质转化为线性和数字检测10的一种手段。液滴数字 PCR (ddPCR) 是原始数字 PCR 方法的最新创新。液滴数字 PCR 是随着先进的微流体和水中油乳状液化学的出现而出现的, 能够可靠地产生稳定和同样大小的液滴。与基于凝胶甚至定量 PCR (qPCR) 不同, Ppcr 会产生输入材料的绝对定量。Dpcr 的关键是通过将样品分成液滴来产生 ~ 20, 000个单独的反应。在终点 PCR 之后, 液滴读取器以流动-柏树式的方式扫描每个液滴, 计数、施胶大小, 并记录每个液滴中是否存在荧光 (即每个液滴中没有或不存在 PCR 放大器)。然后, 利用泊松的分布, 根据正液滴与液滴总数的比率来估计输入分子。此数字表示每个 PCR 中输入分子数量的估计。此外, 在96孔板上进行了 Pdpcr, 并对其进行了分析, 使用户能够运行许多样品, 并执行生物和技术复制, 以便进行适当的统计分析。因此, 我们将 Dpcr 的强大定量和中等通量特性与 TRAP 检测方法结合起来, 开发了 ddPCR 检测11。本方法旨在为用户研究和有力地量化生物样本11,12的绝对端粒酶活性。DdTRAP 的灵敏度使其能够量化有限和珍贵样品中的端粒酶活性, 包括单细胞测量。此外, 使用者还可以研究端粒酶操作和药物的影响, 绝对定量小于两倍的变化 (约50% 差异)。DdTRAP 是 TRAP 检测技术向现代实验室实验和临床环境的数字化和高吞吐量过程的自然演变。
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Protocol
1. 缓冲液的准备和储存
- 制备50毫升的1x 库存 rnase-dnase 游离 np-40 裂解缓冲液 (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 ML MgCl2, 1 mm 乙二胺四乙酸 (edta), 1% [vol/vol] np-40, 10% [vol/vol] 甘油, 150 mM nacl, 5 mm β-硫醇, 和 0.1 mm 4-盐酸苯磺酰氟 (AEBSF)。此缓冲液可在-20°c 下进行采样和存储, 以供将来使用。避免冻融循环, 以获得最佳的细胞裂解。
- 准备50毫升的10倍库存 Rnase-/DNAS 无 trap 扩展缓冲液 (200 mM Tris-HCl [pH 8.0], 15 ML MgCl2, 630 Mm kcl, 0.5% [Vol/vol] tween 20, 和10Mm 乙二醇-之二 (β-氨基乙醚)-N, N, n '-四乙酸 (egta))。该缓冲液可输入1毫升的等价物, 并存储在-20°c, 供将来使用。
2. 细胞裂解
-
细胞的制备
- 解冻 np-40 裂解缓冲液的冷冻脂肪。解冻后, 将裂解缓冲液放在冰上。在 NP-40 裂解缓冲液中加入苯基甲基磺酰氟 (PMSF 蛋白酶抑制剂), 最终浓度为 0.2 mM。
注: 这应该在对细胞进行裂解之前立即完成。 - 从收集的细胞颗粒中取出多余的液体, 以确保电池颗粒干燥。请注意, 细胞颗粒, 无论是新鲜收集的还是以前冷冻的 (-80°c 或冻结在n2 液体中的闪光), 不得含有以前离心机的任何剩余溶液, 因为这些溶液可能会干扰下游程序。
- 生长、收集和冻结端粒酶阳性和端粒酶阴性细胞系 (BJ 成纤维细胞、IMR-90 或 U2OS), 以便将其用作阳性和阴性对照。每次进行检测时使用新的控制裂解液, 以确保检测的重现性。
注: 建议在冷冻前培养大量端粒阴性细胞, 以去除在细胞系长期培养过程中可能引入的任何与组织培养有关的伪影, 从而帮助确保可重现的结果。负控制样本。 - 将细胞颗粒放在冰上。如果细胞被冷冻, 让它们在冰上短暂解冻。
注: ddTRAP 的典型细胞颗粒尺寸在 500, 000 至 1, 000, 000个细胞之间。如果有必要, 也可以使用较小的细胞颗粒, 但理想情况下, 必须知道的细胞号。DdTRAP 还可以使用 BCA 蛋白检测 (输入通常为 1μg) 来基于蛋白质输入进行。
- 解冻 np-40 裂解缓冲液的冷冻脂肪。解冻后, 将裂解缓冲液放在冰上。在 NP-40 裂解缓冲液中加入苯基甲基磺酰氟 (PMSF 蛋白酶抑制剂), 最终浓度为 0.2 mM。
-
细胞的裂解
- 将 NP-40 裂解缓冲液中的细胞裂解。保持细胞等效性 25, 000 细胞/μl 的缓冲液。例如, 将颗粒 (含有 1, 000, 000个细胞) 在40μl 的 NP-40 裂解缓冲液中裂解。轻轻地向上和向下移液, 以打破细胞的开放。尽量避免制造气泡。
- 让细胞在冰上裂解 30分钟, 确保在裂解液中轻轻涡旋, 以防止成簇的细胞碎片形成。这可以每10分钟完成一次, 目的是保持裂解液的均质混合物。
- 在 NP-40 裂解缓冲液中稀释细胞裂解液 (25, 000 细胞酶) 1:20, 使新细胞等价 1, 250 细胞。例如, 将5μl 的细胞裂解液稀释成95μl 的裂解缓冲液。
3. 端粒酶扩展反应
- 为端粒酶扩展反应 (每个反应) 准备一个主混合物 (表 1)。
注: 最好在细胞裂解过程中准备扩展反应母组合, 并将其储存在冰上。- 将延伸主管的管道48μl 混合到每个 PCR 管中。
- 在延伸反应中加入2Μl 的稀释 (1, 250 细胞/Μ-l) 裂解物。总体积现在应该是 50μl, 最终细胞当量为50细胞/Μl。
- 执行端粒酶扩展反应 (表 2)。
- 将端粒酶延伸产品存放在4°c 下, 最长可达 3-5天;但是,最好在前24小时内使用扩展产品。
4. 液滴数字 PCR 设置
- 为 ddTRAP 准备一个主混合物 (表 3) (每个反应)。
注: 一旦试剂在室温下, 不要将其或主混合物放在冰上。将混合物放在冰上可能会增加粘度, 导致液滴形成不良。Dpcr 超混合中的 DNA 聚合酶是一个热门的起点, 在室温下应该是稳定的。在-20°c 的初始解冻后, 可能会将 Pdpcr 超混合物储存在4°c。- 将19.8μl 的 Pdpcr 主混合到每个 PCR 管中。
- 在每个管中加入2.2Μl 的延伸反应。请注意, 总体积现在应为22μl。
注: ddTRAP 所需的样品总量为 20μl (细胞等效性为100个细胞)。额外的体积是防止移液器错误或样品丢失的预防措施。
- 设置液滴生成墨盒。
注: 墨盒包含三个标记的不同的井列。- 将根据步骤4.1.2 的反应加载20Μl 到墨盒中的样品井 (中井) 中。在移液样品时避免气泡。
注: 如果有气泡, 请轻轻点击墨盒的一侧, 使这些气泡到达溶液的顶部。 - 将70Μl 的液滴生成油装入油井 (左井)。
注: 为了避免污染, 请严格使用一套单独的移液器和吸管来生成 Dpcr 液滴步骤。加载墨盒的顺序很重要。由于油比较重, 样品必须在装载前加载, 并将填充微流化室, 导致液滴形成不良。可以运行的最小样本数是8。弹药筒的所有井都必须装上样品, 因为任何空井都会导致液滴发电机产生的液滴停止。如果没有足够的样品来装载墨盒内的所有8口井, 则可以将20Μl 的 ddTRAP 主混合物 (步骤 4.1) 装入剩余的墨盒。 - 通过将垫圈固定在墨盒的两端, 将其固定到位。
注: 垫片的缺乏或放置不当将阻止发电机产生液滴。 - 将装载和组装的墨盒放入液滴发生器中。
注: 墨盒由发电机中的磁铁识别, 当墨盒正确放置时, 磁磁铁将通知用户。
- 将根据步骤4.1.2 的反应加载20Μl 到墨盒中的样品井 (中井) 中。在移液样品时避免气泡。
- 生成液滴并完成循环后, 取出墨盒 (~ 60–90)。
- 轻轻地从墨盒中取出垫圈。使用多通道移液器将新生成的液滴 (右井) 移入96孔 PCR 板。
注: 新产生的液滴乳液的近似体积应为40–43μl。 - 在所有样品装入96孔板后, 用铝箔 PCR 板密封板进行热密封, 以防止在 PCR 步骤中蒸发。
- 轻轻地从墨盒中取出垫圈。使用多通道移液器将新生成的液滴 (右井) 移入96孔 PCR 板。
- 将96孔板加载到热环机中, 并进行以下 PCR 反应 (表 4)。
注: 温度步骤之间的所有坡道速率都必须设置为 2.5°c/, 以便正确加热反应。
5. 端粒酶延伸产品的检测
- 将96孔板装入液滴读取器中。
注: 请确保正确定位板, 使a1样品与支架的样品相匹配。- 打开与液滴读取器关联的软件。双击第一个井a1以打开 samplewell 编辑器屏幕。
- 单击 "实验" , 然后从下拉菜单中选择abs 。
注:实验定义了要使用的检测类型 (即绝对定量或基因拷贝数分析)。Abs代表绝对量化。 - 选择Qx200 Dpcr Evagreen Supermix,以确保读取器采用正确的检测方法。单击井编辑器屏幕右下角的"应用",将用户定义的设置保存到所有突出显示的井。
注: supermix定义了读者将读取的 PCR 混合和检测化学的类型。 - 单击软件的 "良好编辑器" 屏幕中的"目标" , 以定义示例。
- 通过单击"目标"下拉菜单并选择未知、引用或ntc (无模板控件) 来定义示例的类型。
注:未知将指实验样品,参考可能是已知端粒酶活性的控制样本,而 ntc是确定检测有效性的关键控制, 在污染和背景信号。 - 在 "示例名称"部分中标记所有示例, 然后单击 "应用",以确保对突出显示的井进行适当编辑。
- 单击 "运行"以运行/读取板。当提示通知计算机应读取板材的方向时, 请在 "运行选项"屏幕中选择 "列"或"行" 。
6. 数据分析
- 通过单击各个井, 确定每个样本的可接受液滴数。双击各个井或列标题以查看和分析示例数据。
注: 关于是否继续分析特定样品的最重要标准是 "可接受的液滴" 的数量。对于 ddTRAP, 具有 10, 000个或更多可接受的液滴的样品可用于进一步分析。数据可以以多种格式提供给用户, 包括. csv 表、. jpg 图像、直方图等。有许多资源可用于深入分析 dpcr 数据, 包括 ddtrp11、13.这些资源为分析 ddtrap 数据提供了指导, 从选择阈值11、13 到选择样本进行进一步分析11、13、识别误报和阴性13, 以及常规故障排除13。 - 突出显示表示样品复制和 NTC 样品的井。将样本与 NTC 或负控制线 (如 BJ 单元) (如上面步骤2.1.2 中列出) 进行比较。
- 通过单击屏幕左下角用于设置阈值的图标, 手动设置示例的阈值。一次为每个井或多个井设置阈值 (推荐)。
注: 如果在 NTC 中检测到背景, 则可以从所有其他样本中减去它, 以 "归一化" 信号, 并确保只分析真正的正信号。NTC 值通常在 NP-40 裂解缓冲系统的0.2:1 分子范围内。需要测试其他缓冲系统和组件 (例如, CHAPS 缓冲区)。
- 通过单击屏幕左下角用于设置阈值的图标, 手动设置示例的阈值。一次为每个井或多个井设置阈值 (推荐)。
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Representative Results
使用 ddTRAP, 在由以下细胞系组成的细胞面板中测量端粒酶活性 (图 1): 非小细胞肺癌 (H2882、H1299、Calu6、H920、A549 和 H2882)、小细胞肺癌 (h82 和 SHP77) 和端粒阴性成纤维细胞 (BJ)。在 NP-40 缓冲液中裂解了100万种细胞颗粒, 并在生物三重奏中进行端粒酶扩展反应。一个常见的和高度推荐的负控件是 "NTC", 无模板控件。该样品是通过在端粒酶扩展反应中添加 NP-40 裂解缓冲液 (2Μl), 并以相同的方式与含有实际细胞裂解液的其他样品进行扩展产品, 从而生成的。此示例允许用户减去背景信号 (如果有), 以更好地量化端粒酶活性。虽然没有显示在这个图中, 也有可能热失活裂解液在95°c 之前的端粒酶扩展反应5分钟作为另一个负对照。如果细胞样本丰度不是问题, 则首选这种负控制。
通过测量液滴乳状液中每一个液滴的荧光强度, 液滴读取器能够使用泊松分布估计输入分子 (分子分子/微升) 的浓度 (图 1a)。在 ddTRAP 的情况下, 这些输入分子是端粒酶的延伸产物。Dddtrap 检测的机理如下: 端粒酶扩展了 TS 底物。这些扩展底物作为 Pcpcr 模板在 Dpcr 中的作用。Pcr 扩增底物的定量提供了在给定细胞系内端粒酶活性的表示。每个液滴都绘制得如图 1A所示。设定 ddTRAP 的阈值可能是主观的;但是, 使用适当的负控件, 用户可以轻松地执行此操作。在图 1a 所示的示例中, 为 Shp77、H2887 和 ntc 的所有三个生物复制设置了阈值。正液滴的荧光强度约为 6, 000个荧光振幅 (FA), 在顶部形成清晰的种群, 并与负液滴分离约 1, 100 fa。因此, 在本实验中, 阈值可设置为 ~ 2, 000fa。
一旦收集和导出数据, 就可以计算所有样品之间每个细胞等效的端粒酶扩展产品总量 (图 1b)。每口井发出的信号都是绝对浓度 (分子/微升)。通过将浓度乘以 20 (样品的输入体积为 Dpcr 墨盒), 用户可以获得分子的总数。这个数字可以除以已知的细胞等效数 (在我们的 ddTRAP 性能中, 我们使用了100个细胞)。此最终值是在每个细胞等效的端粒酶扩展产品的单位中, 如y轴所示。
图 1: 肺癌面板中的端粒酶活性.Shp77、H2887 和 NTC 的液滴荧光强度 (荧光振幅) 的1D 振幅.选择了 SHP77、H2887 和 NTC 的水井, 并将人工阈值定为 2, 000 FA。(B) 端粒酶活性是根据 PCR 后检测到并绘制的核酸浓度估算的, 以便比较肺癌中端粒酶的活性。FA = 荧光振幅单位。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
端粒酶活性的测量对于大量的研究主题至关重要, 包括但不限于癌症、端粒生物学、衰老、再生医学和基于结构的药物设计。端粒酶 RNPs 含量低, 即使在癌细胞中也是如此, 这使得这种酶的检测和研究具有挑战性。本文介绍了新开发的 ddTRAP 检测在细胞中对端粒酶活性进行有力量化的分步过程。通过将传统的端粒酶扩展反应与 Dpcr 相结合, 我们能够定量检测肺癌细胞中端粒酶活性 (端粒酶扩展产物)。
DdTRAP 分析依赖于与 TRAP 检测相同的理论。细胞裂解物是通过在非离子洗涤剂 (NP-40) 裂解缓冲液中裂解细胞来维持酶活性, 然后用于执行 "TS" 下酯酶扩展反应。DdTRAP 的新颖性依赖于 PCR 前液滴的形成。将样品分解成液滴, 使检测能够获得每个细胞端粒酶活性的绝对定量。
利用 ddTRAP 测定肺癌细胞系端粒酶活性。基于凝胶的 TRAP 检测的主要局限性之一是一次可以处理的样品数量。大多数凝胶梳子最多只能容纳20个井/样品。相比之下, ddTRAP 一次最多可以运行96个样本, 显著增加了可以同时处理的样本数量。我们检测了8个细胞系的端粒酶活性。最重要的是, 我们在生物三聚体中运行了每个端粒酶扩展反应, 总共有24个扩展反应。然后, 我们能够运行每个扩展反应作为三个技术复制 PCR 总共72个样品在 Dpcr 板上。此外, ddTRAP 分析提供可重复的结果, 100个细胞等价物的交叉日 CV (变异系数) 为 5.1%, 100个细胞等价物的日内 CV 为8.61。中间和盘中表示生物复制运行在两个不同的板块或同一板块, 分别在 HeLa 细胞裂解液11。如果72个样品是在传统的 TRAP 或任何其他基于凝胶的检测中处理的, 则需要更多的动手时间。这导致试剂成本较高, 学生/受训者需要更多的宝贵时间, 凝胶与凝胶的可变性较高, 用户和实验室之间缺乏可重复性。与基于凝胶的检测相比, 在 ddTRAP 中可靠、轻松地运行复制的能力是一个显著的改进, 它允许更有效地处理更多的样品, 这有助于对数据进行统计分析。
最后, ddTRAP 中的样品之间的差异较小, 并且可以执行必要的复制, 从而使用户能够观察到样本之间不到两倍的变化。大多数凝胶检测的主要局限性在于缺乏适当的定量。在这里, 使用 ddTRAP, 我们可以检测到不同肺癌系之间的细微差异。在比较针对端粒酶活性的药物和决定是否与高通量屏幕中的小分子化合物一起前进时, 这些细微的差异可能是至关重要的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
提交人感谢国家卫生研究院 (NIH) 的资金来源 (NCI-R00-C197672-01A1)。小细胞肺癌系 (SHP77 和 H82) 是来自 UT 西南医疗中心的 John Minna 博士和 Adi Gazdar 博士的慷慨礼物。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
References
- Frenck, R. W. Jr, Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
