飞秒激光的光刺激激活目标细胞中的细胞外信号调节激酶(ERK)信号或线粒体事件
Summary
紧密聚焦的飞秒激光可以结合到共聚焦显微镜中,从而对细胞提供精确的刺激,从而实现实时观察和光刺激。光刺激可以激活细胞分子事件,包括ERK信号通路和反应氧物种的线粒体闪光。
Abstract
直接控制细胞定义的分子事件对生命科学很重要。最近,研究表明,飞秒激光刺激可以同时激活多个细胞分子信号通路。在此协议中,我们表明,通过将飞秒激光耦合到共聚焦显微镜中,通过紧密聚焦的激光可以精确刺激细胞。一些可以同时观察到的分子过程随后被激活。我们提出了光刺激的详细方案,以激活Hela细胞中的细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路。如果将飞秒激光脉冲聚焦到特定的线粒体管状结构上,也可以刺激活性氧物种 (ROS) 和其他线粒体事件的线粒体闪光。该协议包括光刺激前对细胞进行预处理,通过飞秒激光照射到靶上进行光刺激,以及观察/识别随后的分子变化。该协议是相关生物研究的全光学工具。
Introduction
控制细胞信号分子的技术是生命科学发展的重要组成部分。传统上,最常用的方法是用药物或生物材料1、2、3进行生化处理。在过去的十年里,光遗传学的发明开启了细胞分子信号调制的新时代。基因工程对光敏感蛋白的转染使光成为调节靶细胞中各种蛋白质活性的有力工具。该技术取得了令人鼓舞的进展,如激发和抑制神经信号,促进基因表达,操纵细胞信号模式,导致不同的细胞命运和病理调查4,5 ,6,7,8,9.然而,光只能通过用光遗传蛋白转染细胞来工作。在现阶段,除了光遗传学之外,还有一种罕见的使光能够直接控制细胞分子的方法。
飞秒激光在保持良好生物安全性的同时,通过提供高效的多光子激发,在生物学方面具有先进的生物学研究。通过部署多种光处理策略,它取得了多光子显微镜、微手术和多光子光遗传学应用10、11、12、13等多项成果。 ,14,15,16.近期的研究表明,飞秒激光刺激已被证明是直接诱发分子信号事件的一种高效光学方法。研究发现,对内质视网膜(ER)的紧聚焦飞秒激光照射能够耗尽ER中的钙,并激活钙释放活性钙(CRAC)通道,在细胞17中形成钙信号。这种光激活的钙信号可以在多种类型的细胞之间传播18,19,20。此外,它还能够激活细胞信号通路,如激活T细胞(NFAT)的核因子和ERK信号通路21,22。通过调整细胞中飞秒激光照射的强度和定位,例如,将激光聚焦在线粒体上,可以影响线粒体形态和分子事件23、24 25.具体来说,线粒体ROS的突发可以通过光刺激激发,光刺激被称为线粒体(线粒体)中的荧光闪烁。
因此,光刺激技术在相关生物研究中具有广泛的应用潜力。这也是一个扩大飞秒激光应用在控制细胞信号分子和功能,除了显微镜的好机会。在这里,我们提供光刺激的技术细节。光刺激是通过将飞秒激光耦合到共聚焦显微镜来实现的,从而提供具有短闪光光刺激的单靶细胞。它可以在细胞中启动高效且可控的 ERK 激活。如果光刺激位于线粒体管状结构上,线粒体膜电位、形态、ROS和渗透性过渡孔隙,都可以由光刺激控制。基于该光刺激方案,我们提供了激活ERK信号通路和影响Hela细胞中多个线粒体事件的详细方法。该协议阐明了向目标细胞提供飞秒激光刺激的过程。
光刺激系统建立在共聚焦显微镜上,带有飞秒激光耦合,可同时进行刺激和连续显微镜。飞秒激光(波长:1,040 nm,重复率:50 MHz,脉冲宽度:120 fs,最大输出平均功率:1 W)在耦合前被分成两个光束。其中一个通过由一对透镜组成的中继望远镜进行引导。然后,它直接反射到目标的后孔径(60x,N.A. = 1.2,水浸)中,形成衍射极限聚焦(Stim-A)。另一种被反射到共聚焦显微镜的扫描光学路径上,作为双光子扫描模式(Stim-B)工作。Stim-A 在视场中心 (FOV) 中显示一个固定焦点。Stim-B 是 FOV 中预先设计的部分共聚焦扫描区域。如图1A所示,显示了 Stim-A 和 Stim-B。二色镜 (DM) 下的 CCD 摄像机提供明场成像,用于监控飞秒激光对焦。
以下实验有一些关键要点。在此协议中,使用飞秒光纤激光源(1040 nm、50 MHz、120 fs)作为示例。在实践中,大多数商用飞秒振荡器可以使用,只要脉冲宽度短于200fs,峰值功率密度应高于10 11~1012 W/cm 2的水平。例如,通常用于多光子显微镜的 Ti: 蓝宝石激光能够取代图 1B所示的飞秒激光。激光功率和其他一些光刺激参数需要调整,因为光学参数(脉冲宽度、波长和重复率)在不同的飞秒激光器中变化很大,从而产生不同的多光子激发效率。
与飞秒激光刺激一起,共聚焦显微镜提供连续细胞成像,以Stim-A和Stim-B模式实时监测分子动力学。两种光刺激方案(Stim-A 和 Stim-B)均由具有毫秒分辨率的机械快门控制(图 1)。
在Stim-A模式下,激光对焦的位置固定在FOV的中心。继电器望远镜用于通过调整垂直方向的两个透镜之间的距离(激光传播方向,垂直到共聚焦成像平面,如图 1.通过CCD相机的明场成像,可以测量激光对焦的直径(+2μm,图2B)。刺激持续时间和曝光时间在共聚焦成像过程中由快门控制。
在 Stim-B 模式下,刺激区域可以在共聚焦成像控制软件中手动预分配给任何形式,如直线、多边形或圆。快门与共聚焦扫描过程同步。它在通过共聚焦成像控制软件设置的预设计时间打开。然后,用飞秒激光扫描刺激区域作为共聚焦显微镜。因此,当共聚焦扫描过程进入给定的成像帧时,只有飞秒激光刺激样品。
根据实验对象,可在倒置和直立冶金显微镜上建立光刺激系统。培养在培养皿中的体外细胞更适合倒置显微镜。动物,特别是活体动物的大脑,更适合使用直立显微镜。在这项研究中,我们以倒置显微镜为例。需要注意的是,在整个实验过程中,培养皿的盖子没有打开。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们将飞秒激光与激光扫描共聚焦显微镜系统相结合,演示了光刺激策略。光刺激可以通过相应地定义Stim-B直接作为双光子显微镜。我们提供了一个详细的协议,利用短闪光的飞秒激光触发ERK信号或线闪光的目标细胞。不同的刺激模式可以根据不同的实验目的和系统进行。基于共聚焦显微镜可轻松设置 Stim-A。飞秒激光可以在FOV中心的衍射极限水平聚焦。亚细胞目标需要手动移动到飞秒激光对焦位置,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家自然科学基金(81571719和81661168014、81673014、81870055)、上海市科学技术委员会(18QA1402300和16XD1403100)和国家重点研发计划(2017YFA01046000)的支持。
Materials
| inverted microscope | Olympus | ||
| femtosecond laser | Fianium | ||
| CO2 incubation system | Olympus | MIU-IBC | |
| petri dish | NEST | 801002 | |
| petri dish with imprinted grid | Ibidi | 81148 | |
| ERK-GFP | addgene | 37145 | A gift from Rony Seger's lab |
| mt-cpYFP | A gift from Heping Cheng's lab | ||
| mito-GFP | Invitrogen | C10508 | |
| Tetramethylrhodamine (TMRM) | Invitrogen | T668 | Dilute in DMSO |
| polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | Dilute in PBS |
| paraformaldehyde | Solarbio | P8430 | Dilute in PBS |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | Dilute in PBS |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Dilute in PBS |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| anti-eIF4E antibody | abcam | ab76256 | |
| anti-Bax antibody | abcam | ab53154 | |
| anti-cytochrome C antibody | abcam | ab90529 | |
| secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 |
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