La fotostimolazione da parte del laser Femtosecondo attiva la segnalazione o eventi mitocondriali regolati dal segnale extracellulare (ERK) nelle cellule bersaglio
Summary
Il laser a femtosecondi strettamente focalizzato può fornire una stimolazione precisa alle cellule aggiungendosi a una microscopia confocale che consenta l’osservazione e la fotostimolazione in tempo reale. La fotostimolazione può attivare eventi molecolari cellulari, tra cui percorso di segnalazione ERK e lampi mitocondriali di specie reattive dell’ossigeno.
Abstract
Il controllo diretto degli eventi molecolari cellulari definiti è importante per la scienza della vita. Recentemente, gli studi hanno dimostrato che la stimolazione laser del femtosecondo può attivare simultaneamente più vie di segnalazione molecolare cellulare. In questo protocollo, mostriamo che attraverso l’accoppiamento del laser femtosecondo in un microscopio confocale, le cellule possono essere stimolate con precisione dal laser strettamente focalizzato. Successivamente vengono attivati alcuni processi molecolari che possono essere osservati contemporaneamente. Vi presentiamo protocolli dettagliati della fotostimolazione per attivare il percorso di segnalazione della chinasi regolata dal segnale extracellulare (ERK) nelle cellule di Hela. I lampi mitocondriali di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e altri eventi mitocondriali possono essere stimolati anche se si concentra l’impulso laser del femtosecondo su una certa struttura tubolare mitocondriale. Questo protocollo include il pretrattamento delle cellule prima della fotostimolazione, la fornitura della fotostimolazione tramite un flash laser femtosecondo sul bersaglio e l’osservazione/identificazione dei cambiamenti molecolari in seguito. Questo protocollo rappresenta uno strumento completamente ottico per ricerche biologiche correlate.
Introduction
La tecnologia di controllo delle molecole di segnalazione cellulare è una parte importante dello sviluppo delle scienze della vita. Tradizionalmente, il metodo più comunemente usato è il trattamento biochimico da parte di farmaci o materiali biologici1,2,3. Negli ultimi dieci anni, l’invenzione dell’optogenetica apre una nuova era per la modulazione del segnale molecolare cellulare. La trasfezione con le proteine sensibili alla luce mediante l’ingegneria genica rende la luce un potente strumento per modulare varie attività proteiche nelle cellule bersaglio. Questa tecnologia ha fatto progressi incoraggianti come l’eccitazione e l’inibizione del segnale neurale, la promozione dell’espressione genica, la manipolazione dei modelli di segnale cellulare, la conduttura di diversi destini cellulari e l’indagine patologica4,5 ,6,7,8,9. Tuttavia, la luce può funzionare solo traducendo le cellule con proteine optogenetiche. Nella fase attuale, esistono rari metodi che consentono alla luce di controllare le molecole cellulari direttamente oltre all’optogenetica.
Il laser Femtosecondo ha avanzato ricerche biologiche fornendo un’efficiente eccitazione multifotona pur mantenendo una buona sicurezza biologica. Con l’implementazione di diverse strategie di elaborazione fotografica, ha realizzato numerosi risultati come microscopia multifotone, microchirurgie e applicazioni optogenetiche multifotonia10,11,12,13 ,14,15,16. Recenti indagini dimostrano che la stimolazione laser del femtosecondo è stata dimostrata come un metodo ottico altamente efficiente per indurre direttamente gli eventi di segnalazione molecolare. È stato scoperto che l’irradiazione laser femtosecondi strettamente focalizzata sul reticolo endoplasmico (ER) è in grado di esaurire il calcio in ER e attivare canali di calcio attivato dal rilascio di calcio (CRAC) per formare segnali di calcio nelle cellule17. Questo segnale di calcio foto-attivato può diffondersi tra più tipi di celle18,19,20. Inoltre, ha anche la capacità di attivare le vie di segnalazione cellulare come il fattore nucleare delle cellule T attivate (NFAT) e il percorso di segnalazione ERK21,22. Regolando l’intensità e la localizzazione dell’esposizione al laser femtosecondo nelle cellule, ad esempio, concentrando il laser sui mitocondri, può influenzare la morfologia mitocondriale e gli eventi molecolari23,24, 25. In particolare, le esplosioni di generazione di ROS mitocondriale possono essere eccitate dalla fotostimolazione, che viene sottolineata come lampi fluorescenti nei mitocondri (mitofrangh).
Pertanto, la tecnologia di fotostimolazione è di buon potenziale per essere ampiamente applicata nella ricerca biologica correlata. È anche una buona occasione per estendere le applicazioni laser femtosecondi nel controllo delle molecole di segnalazione cellulare e delle funzioni oltre alla microscopia. Qui, forniamo i dettagli tecnici della fotostimolazione. La fotostimolazione si ottiene acunmando un laser femtosecondo a un microscopio confocale per fornire una singola cellula bersaglio con una breve fotostimolazione flash. Può avviare un’attivazione efficiente e controllabile di ERK nella cellula. Se la fotostimolazione si trova sulla struttura tubolare mitocondriale, il potenziale della membrana mitocondriale, la morfologia, ros e i pori di transizione permeabilità, possono essere tutti controllati dalla fotostimolazione. Sulla base di questo schema di fotostimolazione, forniamo un metodo dettagliato per attivare il percorso di segnalazione ERK e influenzare più eventi mitocondriali nelle cellule di Hela. Questo protocollo chiarisce il processo di stimolazione laser delle femtosecondi nelle cellule bersaglio.
Il sistema di fotostimolazione è stabilito su un microscopio confocale con un accoppiamento laser femtosecondo per la stimolazione simultanea e la microscopia continua. Il laser femtosecondo (lunghezza d’onda: 1.040 nm, velocità di ripetizione: 50 MHz, larghezza dell’impulso: 120 fs, potenza media massima di uscita: 1 W) viene diviso in due fasci prima dell’accoppiamento. Uno è guidato attraverso un telescopio relè costituito da un paio di lenti. Viene quindi riflesso direttamente nell’apertura posteriore di un obiettivo (60x, N.A. – 1,2, immersione in acqua) per formare un focus di diffrazione-limite (Stim-A). L’altro si riflette nel percorso ottico di scansione del microscopio confocale per funzionare come una modalità di scansione a due fotoni (Stim-B). Stim-A presenta un punto focale fisso al centro del campo visivo (FOV). Stim-B è un’area di scansione confocale parziale pre-progettata nel FOV. Stim-A e Stim-B sono mostrate nella Figura 1A. Una telecamera CCD sotto lo specchio dicroico (DM) fornisce immagini a campo luminoso per monitorare la messa a fuoco del laser a femtosecondi.
Ci sono alcuni elementi essenziali per i seguenti esperimenti. In questo protocollo, una fonte laser in fibra femtosecondo (1040 nm, 50 MHz, 120 fs) viene utilizzata come esempio. In pratica, la maggior parte degli oscillatori femtosecondi commerciali può essere utilizzata fintanto che la larghezza dell’impulso è inferiore a 200 fs e la densità di potenza massima dovrebbe essere superiore al livello di 1011 x 1012 W/cm2. Ad esempio, un laser Ti: Sapphire di solito utilizzato per la microscopia multifotone è in grado di sostituire il laser femtosecondo mostrato in Figura 1B. La potenza laser e alcuni altri parametri di fotostimolazione devono essere sintonizzati perché i parametri ottici (larghezza dell’impulso, lunghezza d’onda e frequenza di ripetizione) variano molto in diversi laser femtosecondi che inducono così diverse efficienze di eccitazione multifotone.
Insieme alla stimolazione laser del femtosecondo, la microscopia confocale fornisce l’imaging cellulare continuo per monitorare la dinamica molecolare in tempo reale sia nei modi Stim-A che Stim-B. Entrambi gli schemi di fotostimolazione (Stim-A e Stim-B) sono controllati da un otturatore meccanico con risoluzione dei millisecondi (Figura 1).
Nella modalità Stim-A, la posizione della messa a fuoco laser è fissa al centro di FOV. Un telescopio relè viene utilizzato per garantire che la messa a fuoco del laser femtosecondo sia posizionata sul piano di imaging confocale regolando la distanza tra due lenti nella direzione verticale (la direzione di propagazione laser, verticale al piano di imaging confocale, come mostrato nella Figura 1). Con l’imaging del campo luminoso della fotocamera CCD, è possibile misurare il diametro della messa a fuoco laser (2 m, Figura 2B). La durata della stimolazione e i tempi di esposizione sono controllati da un otturatore durante il processo di imaging confocale.
In modalità Stim-B, l’area di stimolazione può essere pre-assegnata manualmente nel software di controllo dell’imaging confocale a qualsiasi forma come linea, poligono o cerchio. L’otturatore è sincronizzato con il processo di scansione confocale. Si apre al tempo pre-progettato che viene impostato attraverso il software di controllo dell’imaging confocale. Quindi, l’area di stimolazione viene scansionata dal laser femtosecondo come microscopia confocale. Pertanto, il campione viene stimolato dal laser del femtosecondo solo quando il processo di scansione confocale entra in un dato telaio di imaging.
Il sistema di fotostimolazione può essere stabilito su microscopi metallurgici invertiti ed eretti in base ai soggetti dell’esperimento. Le cellule in vitro coltivate nei piatti Petri sono meglio lavorare con microscopi invertiti. Gli animali, in particolare i cervelli di animali vivi, sono più adatti con microscopi eretti. In questo studio, prendiamo come esempio il microscopio invertito. Va notato che la copertura del piatto Petri non viene aperta durante l’intero esperimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dimostriamo una strategia di fotostimolazione combinando un laser a femtosecondi con un sistema al microscopio confocale a scansione laser. La fotostimolazione può funzionare direttamente come una microscopia a due fotoni definendo Stim-B di conseguenza. Forniamo un protocollo dettagliato per l’utilizzo di un breve flash del laser a femtosecondi per attivare la segnalazione elamentatrici nelle celle bersaglio. Le diverse modalità di stimolazione possono essere eseguite secondo diversi scopi sperimentali e sistemi. Stim…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81571719 e 816611168014, 81673014 e 81870055), Shanghai Municipal Science and Technology Committee (18QA1400 e 16XD1403100) e National Key R&D Plan (2017Yy01040).
Materials
| inverted microscope | Olympus | ||
| femtosecond laser | Fianium | ||
| CO2 incubation system | Olympus | MIU-IBC | |
| petri dish | NEST | 801002 | |
| petri dish with imprinted grid | Ibidi | 81148 | |
| ERK-GFP | addgene | 37145 | A gift from Rony Seger's lab |
| mt-cpYFP | A gift from Heping Cheng's lab | ||
| mito-GFP | Invitrogen | C10508 | |
| Tetramethylrhodamine (TMRM) | Invitrogen | T668 | Dilute in DMSO |
| polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | Dilute in PBS |
| paraformaldehyde | Solarbio | P8430 | Dilute in PBS |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | Dilute in PBS |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Dilute in PBS |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| anti-eIF4E antibody | abcam | ab76256 | |
| anti-Bax antibody | abcam | ab53154 | |
| anti-cytochrome C antibody | abcam | ab90529 | |
| secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 |
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