Photostimulatie door Femtosecond Laser activeert extracellulaire-Signal-gereguleerde kinase (ERK) signalering of mitochondriale gebeurtenissen in doelcellen
Summary
Strak gerichte femtosecondelaser laser kan precieze stimulatie naar cellen leveren door te worden gekoppeld aan een confocale microscopie die de real-time observatie en foto stimulatie mogelijk maakt. De foto stimulatie kan celmoleculaire gebeurtenissen activeren, waaronder ERK-signalerings traject en mitochondriale flitsen van reactieve zuurstof soorten.
Abstract
Directe controle van cellulaire gedefinieerde moleculaire gebeurtenissen is belangrijk voor Life Science. Onlangs hebben studies aangetoond dat femtosecondelaser Laser stimulatie gelijktijdig meerdere cellulaire moleculaire signalerings trajecten kan activeren. In dit protocol laten we zien dat door het koppelen van femtosecondelaser laser in een confocale Microscoop, cellen precies kunnen worden gestimuleerd door de strak gerichte laser. Sommige moleculaire processen die gelijktijdig kunnen worden waargenomen, worden vervolgens geactiveerd. We presenteren gedetailleerde protocollen van de photostimulatie te activeren extracellulaire signaal gereguleerd kinase (ERK) signalering traject in HeLa cellen. Mitochondriale flitsen van reactieve zuurstof soorten (ROS) en andere mitochondriale gebeurtenissen kunnen ook worden gestimuleerd als het concentreren van de femtosecondelaser laserpuls op een bepaalde mitochondriale buisvormige structuur. Dit protocol omvat het voorbehandelen van cellen vóór foto stimulatie, het afleveren van de foto stimulatie door een femtosecondelaser Laser flits op het doelwit en het observeren/identificeren van moleculaire veranderingen achteraf. Dit protocol vertegenwoordigt een all-optisch hulpmiddel voor aanverwante biologische onderzoeken.
Introduction
De technologie van het beheersen van cellulaire signalering moleculen is een belangrijk onderdeel van de ontwikkeling van de levenswetenschappen. Traditioneel, de meest gebruikte methode is biochemische behandeling door drugs of biologische materialen1,2,3. In het afgelopen decennium, de uitvinding van optogenetics opent een nieuw tijdperk voor cellulaire moleculaire signaal modulatie. Transfectie met lichtgevoelige eiwitten door genengineering maakt licht uitgegroeid tot een krachtig hulpmiddel om verschillende proteïne-activiteiten in de doelcel te moduleren. Deze technologie heeft bemoedigende vorderingen gemaakt, zoals excitatie en remming van het neurale signaal, het bevorderen van genexpressie, het manipuleren van cellulaire signaal patronen, het leiden van verschillende celfates en pathologisch onderzoek4,5 ,6,7,8,9. Licht kan echter alleen werken door transfecterende cellen met optogenetische eiwitten. In de huidige fase, er bestaan zeldzame methoden die licht in staat stellen om cellulaire moleculen direct naast optogenetics controleren.
Femtosecond laser heeft geavanceerde biologische onderzoeken door het verstrekken van efficiënte multiphoton excitatie met behoud van goede biologische veiligheid. Door diverse fotoverwerkings strategieën te implementeren, heeft het tal van prestaties gerealiseerd, zoals multiphoton microscopie, microsurgeries en multiphoton optogenetische toepassingen10,11,12,13 ,14,15,16. Recente onderzoeken tonen aan dat femtosecondelaser Laser stimulatie is aangetoond als een zeer efficiënte optische methode om moleculaire signalering van gebeurtenissen direct te induceren. Er is geconstateerd dat strak gerichte femtosecondelaser laser bestraling op endoplasmisch reticulum (ER) calcium in ER kan afbreken en calcium-vrijgave-geactiveerde calcium (CRAC)-kanalen kunnen activeren om calcium signalen in cellen17te vormen. Dit foto-geactiveerde calcium signaal kan zich verspreiden tussen meerdere soorten cellen18,19,20. Bovendien, het heeft ook de mogelijkheid om het activeren van de cel signalering trajecten zoals nucleaire factor van geactiveerde T-cellen (nfat) en ERK signalering traject21,22. Door het aanpassen van de intensiteit en lokalisatie van femtosecondelaser Laser blootstelling in cellen, bijvoorbeeld, het concentreren van de laser op mitochondriën, het kan beïnvloeden mitochondriale morfologie en moleculaire gebeurtenissen23,24, 25. in het bijzonder, uitbarstingen van mitochondriale Ros generatie kan worden opgewonden door photostimulatie, die is gemarkeerd als fluorescerende flitsen in mitochondriën (mitoflashes).
Vandaar dat de photostimulatie technologie van goed potentieel is om op grote schaal toegepast te worden in verwant biologisch onderzoek. Het is ook een goede kans om uit te breiden femtosecondelaser lasertoepassingen in het beheersen van cellulaire signalering van moleculen en functies naast microscopie. Hier bieden we de technische details van photostimulatie. De foto stimulatie wordt bereikt door een femtosecondelaser laser te koppelen aan een confocale Microscoop om een enkelvoudige doelcel te bieden met een korte flits fotostimulatie. Het kan efficiënte en bestuurbare ERK-activering in de cel initiëren. Als de foto stimulatie is gelegen op de mitochondriale buisvormige structuur, de Mitochondriale membraanpotentiaal, morfologie, ROS, en permeabiliteit overgang poriën, kunnen allemaal worden bestuurd door de foto stimulatie. Op basis van dit photostimulatie schema bieden we een gedetailleerde methode om ERK-signalerings traject te activeren en meerdere mitochondriale gebeurtenissen in HeLa-cellen te beïnvloeden. Dit protocol aanvult het proces van het leveren van femtosecondelaser Laser stimulatie in doelcellen.
Het foto stimulatie systeem wordt ingesteld op een confocale Microscoop met een femtosecondelaser Laser koppeling erin voor gelijktijdige stimulatie en continue microscopie. De femtosecondelaser Laser (golflengte: 1.040 nm, herhalingssnelheid: 50 MHz, pulsbreedte: 120 FS, maximaal uitgangs gemiddelde vermogen: 1 W) wordt voor koppeling gesplitst in twee stralen. Een wordt geleid door een relais telescoop bestaande uit een paar lenzen. Het wordt dan direct weerspiegeld in de Achteropening van een doelstelling (60x, N.A. = 1,2, onderdompeling in water) om een diffractie-grens focus te vormen (STIM-A). De andere wordt weerspiegeld in het Scanning optische pad van confocale Microscoop om te werken als een twee-photon Scanning mode (STIM-B). STIM-A presenteert een vast scherpstelpunt in het midden van het gezichtsveld (FOV). STIM-B is een vooraf ontworpen gedeeltelijke confocale scanning gebied in de FOV. STIM-A en STIM-B worden weergegeven in Figuur 1a. Een CCD-camera onder de dichroïde spiegel (DM) biedt helder-veld beeldvorming voor het bewaken van de focus van femtosecondelaser laser.
Er zijn enkele cruciale essentiële benodigdheden voor de volgende experimenten. In dit protocol wordt een femtosecondelaser Fiber laserbron (1040 nm, 50 MHz, 120 FS) als voorbeeld gebruikt. In de praktijk kunnen de meeste commerciële femtosecondelaser-oscillatoren worden gebruikt zolang de pulsbreedte korter is dan 200 FS en de piek vermogensdichtheid boven het niveau van 1011 ~ 1012 W/cm2moet liggen. Bijvoorbeeld, een TI: saffier laser meestal gebruikt voor multiphoton microscopie is in staat om de femtosecondelaser laser te vervangen toonde in Figuur 1b. De laser kracht en enkele andere fotostimulatie parameters moeten worden afgesteld omdat de optische parameters (pulsbreedte, golflengte en herhalingssnelheid) veel variëren in verschillende femtosecondelaser-lasers die zo verschillende multiphoton-excitatie-efficiëntie opwekken.
Samen met femtosecondelaser Laser stimulatie biedt de confocale microscopie continue celbeeldvorming om de moleculaire dynamiek in real-time te bewaken in zowel Stim-A als Stim-B modes. Beide foto stimulatie schema’s (STIM-A en STIM-B) worden bestuurd door een mechanische sluiter met een resolutie van milliseconde (Figuur 1).
In Stim-A mode, de positie van laser focus is vastgesteld in het centrum van FOV. Een relais telescoop wordt gebruikt om de focus van femtosecondelaser laser te vinden op het confocale beeldvormings vlak door de afstand tussen twee lenzen in de verticale richting te tunen (de laser propagatie richting, verticaal naar het confocale beeldvlak, zoals weergegeven in Figuur 1). Door de helder-veld beeldvorming van de CCD-camera kan de diameter van de laser focus worden gemeten (~ 2 μm, Figuur 2b). De duur van de stimulatie en de blootstellings tijden worden geregeld door een sluiter tijdens het confocale beeldvormings proces.
In de Stim-B-modus kan het stimulatie gebied handmatig worden toegewezen in de confocale Imaging Controlling-software op elke vorm zoals lijn, veelhoek of cirkel. De sluiter wordt gesynchroniseerd met het confocale scanproces. Het opent op de vooraf ontworpen tijd die is ingesteld door de confocale Imaging Controlling software. Vervolgens wordt het stimulatie gebied gescand door femtosecondelaser laser als confocale microscopie. Zo wordt het monster alleen gestimuleerd door femtosecondelaser Laser wanneer het confocale scanproces een bepaald beeld frame binnenkomt.
Het fotostimulatie systeem kan worden ingesteld op zowel omgekeerde als staande metallurgische microscopen volgens de proefpersonen. In vitro cellen gekweekt in Petri schalen zijn beter om te werken met omgekeerde microscopen. Dieren, in het bijzonder hersenen van levende dieren, zijn meer geschikt voor rechtopstaande microscopen. In deze studie nemen we de omgekeerde Microscoop als voorbeeld. Opgemerkt moet worden dat de cover van Petri schaal niet wordt geopend tijdens de hele experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
We demonstreren een foto stimulatie strategie door een femtosecondelaser laser te combineren met een laser scanning confocale Microscoop systeem. De foto stimulatie kan direct werken als een twee-Fobe microscopie door Stim-B dienovereenkomstig te definiëren. We bieden een gedetailleerd protocol voor het gebruik van een korte flits van femtosecondelaser laser om ERK-signalering of mitoflitsen in doelcellen te activeren. De verschillende stimulatie modi kunnen worden uitgevoerd volgens verschillende experimentele doeleind…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81571719 en 81661168014, 81673014 en 81870055), het Shanghai Municipal Science and Technology Committee (18QA1402300 en 16XD1403100), en het National key R & D plan (2017YFA0104600).
Materials
| inverted microscope | Olympus | ||
| femtosecond laser | Fianium | ||
| CO2 incubation system | Olympus | MIU-IBC | |
| petri dish | NEST | 801002 | |
| petri dish with imprinted grid | Ibidi | 81148 | |
| ERK-GFP | addgene | 37145 | A gift from Rony Seger's lab |
| mt-cpYFP | A gift from Heping Cheng's lab | ||
| mito-GFP | Invitrogen | C10508 | |
| Tetramethylrhodamine (TMRM) | Invitrogen | T668 | Dilute in DMSO |
| polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | Dilute in PBS |
| paraformaldehyde | Solarbio | P8430 | Dilute in PBS |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | Dilute in PBS |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Dilute in PBS |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| anti-eIF4E antibody | abcam | ab76256 | |
| anti-Bax antibody | abcam | ab53154 | |
| anti-cytochrome C antibody | abcam | ab90529 | |
| secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 |
References
- Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).
- Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).
- Scott, J. D., Pawson, T. Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they’re apart. Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).
- Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).
- Steinbeck, J. A., et al. Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell–derived grafts in a Parkinson’s disease model. Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Hoover, E. E., Squier, J. A. Advances in multiphoton microscopy technology. Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).
- Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432 (7019), 822 (2004).
- Tirlapur, U. K., König, K. Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser. Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).
- Shen, N., et al. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mechanics & chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields. Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).
- He, H., et al. Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser. Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).
- Smith, N. I., et al. Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation. Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).
- Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser. Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).
- He, H., et al. Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure. Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).
- Wang, Y., et al. All-optical regulation of gene expression in targeted cells. Scientific reports. 4, 5346 (2014).
- Wang, S., et al. Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser. Laser & Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).
- Yan, W., et al. Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation. Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).
- Wang, Y., et al. Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion. Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).
- Shi, F., et al. Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser. Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).
- Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity. Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).
- Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134 (2), 279-290 (2008).
- Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells. Pharmacology of Mitochondria. , 403-422 (2016).
- Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond. The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).
- Wang, S., Hu, M., He, H. Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser. Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).
