突变黑色素细胞干细胞引发小鼠黑色素瘤的时空控制
Summary
下面的过程描述了一种方法, 空间和时间控制黑素细胞肿瘤开始在小鼠背皮肤, 使用基因工程小鼠模型。该协议描述宏观以及微观皮肤黑色素瘤的启动。
Abstract
皮肤黑色素瘤是众所周知的最具攻击性的皮肤癌。虽然风险因素和主要基因改变继续被记录以越来越深的深度, 但近几十年来, 皮肤黑色素瘤的发病率迅速而持续地增加。为了找到有效的预防方法, 重要的是要了解黑色素瘤在皮肤中开始的早期步骤。先前的数据表明, 在成人皮肤组织中的滤泡黑素细胞干细胞 (Mcsc) 可以作为黑色素瘤细胞的起源, 当表达致癌突变和基因改变。当 Mcsc 从静止状态过渡到活动状态时, 可诱发黑色素瘤易发性 Mcsc 引起的肿瘤发生。这种易黑色素瘤的 Mcsc 的转变可以通过调节毛囊干细胞的活性状态或通过外源环境因素, 如紫外线-b (UV-B) 来促进。这些因素可以在实验室中通过化学脱毛进行人工操作, 从而导致毛囊干细胞和 Mcsc 从静止状态过渡到活动状态, 并通过使用台式光进行 UV-B 照射。这些方法为小鼠背侧皮肤皮肤黑色素瘤的开始提供了成功的空间和时间控制。因此, 这些体内模型系统将有助于确定皮肤黑色素瘤萌发的早期步骤, 并可用于测试肿瘤预防的潜在方法。
Introduction
黑色素瘤是黑色素瘤的恶性形式, 是皮肤中最具攻击性的癌症, 皮肤黑色素瘤占皮肤癌死亡的大多数1。在美国, 黑色素瘤通常被诊断出来;据预测, 在2018年估计的新癌症病例中, 它将是第5至第6种最常见的癌症类型2。此外, 虽然近几十年来癌症的总体发病率呈逐渐下降的趋势, 但在过去几十年中, 皮肤黑色素瘤发病率显示,2 男女的皮肤黑色素瘤发病率都在持续和迅速增加。
为了更有效地对抗皮肤黑色素瘤, 重要的是要清楚地了解黑色素瘤发展的早期事件, 从他们的起源细胞, 以更好地确定临床上有效的预防方法。现在人们知道, 在包括皮肤组织 3、4、5在内的许多不同类型的器官中, 成人干细胞作为癌症的细胞起源,可以显著促进肿瘤的形成。同样, 在小鼠背皮的成人黑细胞干细胞 (Mcsc) 可以作为黑色素瘤细胞的起源时, 异常激活拉斯拉夫和阿克特途径6。然而, 仅这些致癌突变并不能有效地诱导静止的 Mcsc 形成肿瘤, 当 Mcsc 在自然头发循环过程中变得活跃时, 黑色素瘤最终会发展起来。然而, 在这个协议中, 我们将描述的方法, 人为地诱导细胞激活易发生肿瘤的 mcsc, 从而促进黑色素瘤的启动精确控制 6,7。
通过这里描述的方法, 空间和时间控制的皮肤黑色素瘤开始从肿瘤易发的 Mcsc表达致癌 BrafV600e 连同 pten表达的损失, 可以成功地执行, 因为我们此前曾有报道。这种方法结合了先前的研究结果, 表明毛囊干细胞通过脱毛激活, 以及如何小鼠皮肤暴露于 UV-B 可以促进激活 Mcsc 居民的毛囊和这个细胞的移位亚群到卵泡间表皮 6,8,9,10。这些体内模型系统可以提供有关生理和环境变化如何改变易患黑色素瘤的 Mcsc 的细胞状态的宝贵信息, 进而导致皮肤中黑色素瘤的显著启动。
Protocol
Representative Results
Discussion
在皮肤黑色素瘤肿瘤中经常发现的 hallmark 基因改变已经被很好地描述了13。最主要的驱动突变是BrafV600e,和基因工程小鼠模型的 braf v600e 介导黑色素瘤是由博森伯格组14产生, 并沉积在杰克逊实验室. 利用这个小鼠模型, 我们最近的研究证明了细胞激活的要求, 肿瘤易发的 Mcsc 显著启动braf V600e介导的黑色素瘤在背皮肤<sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了主管卫生事务助理国防部长办公室的支持, 该方案通过 W81XWH-1-0272 奖的同行审查癌症研究方案提供了支持。意见、解释、结论和建议是作者的意见、解释、结论和建议, 不一定得到国防部的认可。这项工作也得到了康奈尔大学干细胞计划向 a. c. white 提供的种子赠款的支持。H. Moon 得到了康奈尔大学脊椎动物基因组学研究中心学者计划的支持。
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26g 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG | |
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG | |
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA | |
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA | |
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
References
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