Preparazione delle sezioni ricrello della retina
Summary
Questo rapporto descrive metodi completi per la preparazione di sezioni della retina del topo congelato per l’immunohistochimica (IHC). I metodi descritti includono la dissezione della coppa posteriore oculare, la fissazione della paraformaldeide, l’incorporamento nei supporti e nell’orientamento dei tessuti della temperatura di taglio ottimale (OCT), il sezionamento e l’immunostaining.
Abstract
La preparazione di sezioni oculari del topo di alta qualità per l’immunoistochimica (IHC) è fondamentale per valutare la struttura e la funzione della retina e per determinare i meccanismi alla base delle malattie retiniche. Mantenere l’integrità strutturale durante la preparazione dei tessuti è fondamentale per ottenere dati IHC retinici riproducibili, ma può essere difficile a causa della fragilità e della complessità della citoarchitettura retinica. Fissativi forti come 10% formalina o soluzione di Bouin preservare in modo ottimale la struttura della retina, spesso impediscono l’analisi IHC migliorando la fluorescenza di fondo e/ o diminuendo le interazioni anticorpo-epitope, un processo noto come mascheramento epitopiano. I fissativi più lievi, d’altra parte, come il 4% di paraformaldeide, riduce la fluorescenza di fondo e la mascheratura epitope, devono essere utilizzate tecniche di dissezione meticolose per preservare la struttura retinica. In questo articolo, presentiamo un metodo completo per preparare tazze posteriori oculari del topo per IHC che è sufficiente per preservare la maggior parte delle interazioni anticorpo-epitopo senza perdita di integrità strutturale retinica. Includiamo l’IHC rappresentativo con anticorpi a vari marcatori di tipo cellule retiniche per illustrare la conservazione e l’orientamento dei tessuti in condizioni ottimali e non ottimali. Il nostro obiettivo è ottimizzare gli studi IHC della retina fornendo un protocollo completo dalla dissezione della tazza posteriore oculare all’IHC.
Introduction
L’immunohistochimica (IHC) è una potente tecnica per localizzare specifiche proteine e strutture cellulari nei tessuti in situ1,2,3. Metodi di fissazione inappropriati e sezionamento non ottimale di tessuti complessi possono interrompere la struttura del tessuto, generare un’elevata colorazione di fondo o diminuire le interazioni anticorpo-epitopo, con conseguente colorazione artefatti e conseguente interpretazione errata di Dati IHC4. Poiché la retina vertebrata è un organo neurale complesso e altamente organizzato composto da strati di fotorecettori interconnessi, interneuroni e cellule gangliari, è molto fragile e può essere facilmente interrotto durante la dissezione e la sezionamento. Un protocollo dettagliato, standardizzato e convalidato dalla dissezione dell’occhio del mouse e dall’orientamento all’immunostaining contribuirà a ridurre significativamente gli artefatti IHC, aumentando così l’affidabilità dei risultati e consentendo dati comparativi più accurati analisi.
Ci sono molti protocolli per la preparazione dei tessuti per IHC, tuttavia, non tutti sono adatti per il tessuto retinica. Fissativi forti come 10% formalina o soluzione di Bouin preservare la struttura della retina durante la dissezione e sezionamento5. Sfortunatamente, forti fissativi spesso portano alla maggiore fluorescenza di fondo e mascheramento dell’epitopo a causa della modifica chimica degli epitopi6. D’altra parte, fissativi più miti, come 4% paraformaldeide (PFA) possono alleviare alcuni di questi artefatti, ma richiedono una dissezione meticolosa e la sezionamento per preservare la struttura della retina ottimale. Il PFA penetra rapidamente nel tessuto, ma si incrocia le proteine molto lentamente, riducendo il rischio di mascheramento dell’epitopo. Da breve tempo l’incubazione di PFA è una fissazione relativamente lieve, i tessuti spesso richiedono un congelamento rapido per preservare gli antigeni. È importante evitare la formazione di cristalli di ghiaccio durante il congelamento dei tessuti in quanto distorcono e danneggiano l’integrità delle cellule e dei tessuti7.
Qui descriviamo protocolli dettagliati e standardizzati per la dissezione, la fissazione e la crio-protezione delle tazze posteriori oculari del topo che producono dati IHC coerenti e affidabili.
Protocol
Representative Results
Discussion
La dissezione della retina del topo è un processo delicato a causa delle piccole dimensioni e della forma degli occhi del topo e della fragilità del tessuto retinica. Anche se eseguire dissezione di alta qualità è una questione di pratica, avere un protocollo dettagliato, fornire metodi e suggerimenti efficienti è una necessità per ottenere sezioni retiniche e IHC. Oltre ai protocolli descritti qui, ci sono diversi suggerimenti che consentono sezioni retiniche coerenti di alta qualità che sono adatti per IHC ripro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del NIH (RO1-GMO97327) e della University Research Foundation (UPenn). Ringraziamo in particolare Svetlana Savina per il suo aiuto nello sviluppo del protocollo di immunohistochimica, Gordon Ruthel (Università della Pennsylvania) e Penn Vet Imaging Core per l’assistenza con la microscopia e Leslie King, Ph.D. per la lettura critica di questo manoscritto .
Materials
| 6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm) | Gilson | #MA-48 | For liquid nitrogen (Figure 1E) |
| Aluminum foil | |||
| Cauterizer | Bovie | #AA01 | To mark eye orientation (Figure 1A) |
| Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent | Electron Microscopy Sciences | #72703-D | For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A) |
| Curved scissors, Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | #15002-08 | To circumferentially cut the cornea (Figure 1B) |
| Dental wax-coated 35mm dissection dish | For eye cup dissection (Figure 1C) | ||
| Dissecting microscope | Leica, Houston, USA | MZ12.5 High-performance stereomicroscope | |
| Micro Knives – Plastic Handle | Fine Science Tools | #10315-12 | To make a small incision at the burn mark (Figure 1A) |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | #72660 | For coating dissection dish |
| Slide Rack and Coverplate | Ted Pella | #36107 | For retinal IHC (Figure 1G) |
| Stainless Steel Beaker (89 x 114mm) | Gilson | #MA-40 | For isopentane bath (Figure 1E) |
| Styrofoam box | For insulated cooler | ||
| Thin forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | #11254-20 | To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B) |
| Tissue-Tek cryomold (10mm x 10mm x 5mm) | Electron Miscroscopy Sciences | #62534-10 | Mold for OCT embedding |
| Buffers and Reagents | Company | Catalog Number | Comments |
| Blocking solution | 2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer. | ||
| Gelvatol (anti-fading mounting media) | Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops). Store in amber drop bottle at 4°C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh at 1 ug/mL (1x) |
| Isopentane, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| Paraformaldehyde (PFA) in PBS | Electron Microscopy Sciences | #15710 | Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark. |
| Permeabilization solution | PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3. Prepare fresh. | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4. Prepared from 10x stock |
| Sucrose solutions | Fisher Scientific | #S-5-500 | Dissolve the appropriate amount of sucrose in 37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C. |
| Tissue-Tek OCT-compound | Sakura | #4583 | |
| Antibodies | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | To label horinzotal cells |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | To label GABAergic amacrine cells |
| anti-GS | BD Transduction | 610517 | To label Müller cells |
| anti-rhodopsin | Millipore | MAB5316 | To label rods |
References
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