Développement de lésions locales induites par le ciblage dans les génomes (TILLING) Populations dans les cultures de petits grains par l'éthylique Methanesulfonate Mutagenesis
Summary
Il est décrit comme un protocole pour le développement d’une population de lésions locales induites par le ciblage dans les génomes (TILLING) dans les petites cultures céréalières avec l’utilisation de l’éthyl methanesulfonate (EMS) comme mutagène. Un protocole de détection des mutations utilise l’analyse Cel-1.
Abstract
Cibler les lésions locales induites dans les génomes (TILLING) est un puissant outil de génétique inverse qui comprend la mutagénèse chimique et la détection de la variation de séquence dans les gènes cibles. TILLING est un outil de génomique fonctionnel très précieux pour la validation des gènes, en particulier dans les petits grains où les approches basées sur la transformation ont de sérieuses limites. Le développement d’une population mutagénaire robuste est essentiel pour déterminer l’efficacité d’une étude de validation génétique basée sur TILLING. Une population de TILLING avec une faible fréquence globale de mutation indique qu’une population peu grande doit être examinée pour trouver les mutations désirées, tandis qu’une concentration de mutagène élevée conduit à une mortalité élevée dans la population, conduisant à une insuffisance nombre d’individus mutagérisés. Une fois qu’une population efficace est développée, il existe de multiples façons de détecter les mutations dans un gène d’intérêt, et le choix de la plate-forme dépend de l’échelle expérimentale et la disponibilité des ressources. L’approche à base de gel Cel-1 et de gel d’agarose pour l’identification des mutants est pratique, reproductible et une plate-forme moins gourmande en ressources. Il est avantageux en ce qu’il est simple, ne nécessitant aucune connaissance de calcul, et il est particulièrement approprié pour la validation d’un petit nombre de gènes avec l’équipement de laboratoire de base. Dans le présent article, décrits sont les méthodes pour le développement d’une bonne population DE TILLING, y compris la préparation de la courbe de dosage, la mutagénèse et le maintien de la population mutante, et le dépistage de la population mutante en utilisant le PCR-basé Cel-1 test .
Introduction
Les mutations ponctuelles dans les génomes peuvent servir à de nombreux fins utiles pour les chercheurs. Selon leur nature et leur emplacement, ces mutations peuvent être utilisées pour attribuer des fonctions à des gènes ou même des domaines distincts de protéines d’intérêt. D’autre part, comme source de nouvelles variations génétiques, des mutations utiles peuvent être sélectionnées pour les caractères souhaités à l’aide d’écrans de phénotypage et davantage utilisées dans l’amélioration des cultures. TILLING est un puissant outil de génétique inverse qui comprend la mutagénèse chimique et la détection de la variation de séquence dans le gène cible. D’abord développé dans Arabidopsis1 et Drosophilia melanogaster2, les populations DE TILLING ont été développées et utilisées dans de nombreuses cultures de petits grains telles que le blé à pain hexaploïde (Triticum aestivum)3, orge (Hordeum vulgare)4, blé dur tétraploïde (T. dicoccoides durum)5, blé diploïde (T. monococcum)6 et l’ancêtre du génome “D” du blé Aegilops tauschii7 . Ces ressources ont été utilisées pour valider les rôles des gènes dans la régulation de la tolérance au stress abiotique et biotique8, la régulation du temps de floraison9, et le développement de variétés de cultures nutritionnellement supérieure5.
TILLING, avec l’utilisation d’agents mutagènes alkylants tels que le méthane sulfonate d’éthyle (EMS), l’azide de sodium, N-méthyl-N-nitrosourea (MNU), et le méthanesulfonate de méthyle (MMS), a des avantages sur d’autres outils de génétique inverse pour plusieurs raisons. Tout d’abord, la mutagénèse peut être menée sur pratiquement n’importe quelle espèce ou variété de plante10 et est indépendante du goulot d’étranglement de transformation, qui est particulièrement difficile dans le cas des petits grains11. Deuxièmement, en plus de générer des mutations knock-out qui peuvent être obtenues par d’autres approches de validation des gènes, une gamme de mutations de mauvais sens et d’épissage peut être induite, ce qui peut discerner les fonctions des domaines individuels des protéines d’intérêt12. En outre, TILLING génère une collection immortelle de mutations dans tout le génome; ainsi, une seule population peut être utilisée pour la validation fonctionnelle de plusieurs gènes. En revanche, d’autres outils de génétique inversée génèrent des ressources spécifiques uniquement au gène à l’étude13. Les mutations utiles identifiées par TILLING peuvent être déployées à des fins de reproduction et ne sont pas soumises à la réglementation, contrairement à l’édition génétique, dont la classification non transgénique est encore incertaine dans de nombreux pays. Cela devient particulièrement pertinent pour les petits grains qui sont négociés à l’échelle internationale14.
TILLING est une stratégie de validation génétique simple et efficace qui nécessite le développement de populations mutagénaires pour étudier les gènes d’intérêt. Le développement d’une population mutagénaire efficace est essentiel pour déterminer l’efficacité d’une étude de validation génétique basée sur TILLING. Une population de TILLING avec une faible fréquence globale de mutation indique qu’une population peu large doit être examinée pour les mutations désirées, tandis qu’une concentration de mutagène élevée conduit à une mortalité élevée dans la population et un nombre insuffisant de mutagénaires. Une fois qu’une bonne population est développée, il existe de multiples façons de détecter les mutations dans les gènes d’intérêt, et le choix de la plate-forme dépend de l’échelle expérimentale et la disponibilité des ressources. Le séquençage du génome entier et le séquençage de l’exome ont été utilisés pour caractériser toutes les mutations dans les populations de TILLING chez les plantes ayant de petits génomes15,16. Le séquençage de l’exome de deux populations de TILLING a été effectué dans le pain et le blé dur et est disponible au public pour identifier les mutations souhaitables et commander des lignes mutantes d’intérêt17. Il s’agit d’une grande ressource publique en termes de disponibilité de mutations souhaitables; cependant, dans les études de validation de gène, la ligne sauvage-type devrait posséder le gène d’intérêt de candidat. Malheureusement, il est encore prohibitif de séquencer l’exome de toute la population de TILLING pour la validation inversée basée sur la génétique de quelques gènes candidats dans un autre contexte. Le séquençage d’amplicon et les essais à base de Cel-1 ont été utilisés pour détecter les mutations dans les populations ciblées dans le blé, et les essais cel-1 sont plus simples, ne nécessitant aucune connaissance computationnelle, et sont particulièrement appropriés pour la validation d’un petit nombre de gènes avec des matériel de laboratoire6,18.
Dans le présent article, décrits sont des méthodes pour le développement d’une bonne population DE TILLING, y compris la préparation de la courbe de dosage, la mutagénèse et le maintien de la population mutante, et le dépistage de la population mutante en utilisant le PCR-basé Cel-1 test . Ce protocole a déjà été mis en œuvre avec succès dans le développement et l’utilisation des populations mutagénaires de Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, orge, Aegilops tauchii7, et plusieurs autres. On y trouve des détails explicites de ces méthodes ainsi que des conseils utiles qui aideront les chercheurs à développer des populations de TILLING, en utilisant le SME comme mutagène dans n’importe quelle petite usine céréalière de choix.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING est un outil de génétique inversée très précieux pour la validation des gènes, en particulier pour les petits grains où les approches basées sur la transformation ont de sérieux goulots d’étranglement11. Le développement d’une population mutagénaire avec une fréquence de mutation élevée est l’une des étapes critiques dans la conduite des études de génomique fonctionnelle. L’étape la plus importante dans le développement d’une population robuste de TILLING est de déterm…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’USDA National Institute of Food and Agriculture, le projet Hatch 1016879 et le Maryland Agricultural Experiment Station par l’intermédiaire de la subvention MAES no 2956952.
Materials
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
- Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. Targeted Recovery of Mutations in Drosophila. Génétique. 156 (3), 1169-1173 (2000).
- Tsai, H., et al. Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing. Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).
- Caldwell, D. G., et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.). The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).
- Hazard, B., et al. Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat. Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).
- Rawat, N., et al. A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics. BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).
- Rawat, N., et al. TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
- Rawat, N., et al. Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight. Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).
- Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes. Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).
- Greene, E. A., et al. Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis. Génétique. 164 (2), 731-740 (2003).
- Harwood, W. A. Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).
- Henikoff, S., Comai, L. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).
- Uauy, C., et al. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).
- Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat. Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).
- Li, G., et al. The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies. The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).
- Jiao, Y., et al. A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses. The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).
- Krasileva, K. V., et al. Uncovering hidden variation in polyploid wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).
- Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).
- Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).
- Wu, J. -. L., et al. Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics. Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).
- Feldman, M., Levy, A. A. Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat. Génétique. 192 (3), 763-774 (2012).
- Comai, L. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).
- Guo, H., et al. Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Rakszegi, M., et al. Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program. Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).
- Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. Tilling by Sequencing. Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).
