Desarrollo de lesiones locales inducidas dirigidas en las poblaciones de genomas (TILLING) en cultivos de granos pequeños por mutagénesis etnometametanada
Summary
Descrito es un protocolo para el desarrollo de una población de lesiones locales inducidas dirigidas en genomas (TILLING) en cultivos de grano pequeño con el uso de metanoesulfonato etílico (EMS) como mutágeno. También se proporciona un protocolo para la detección de mutaciones utilizando el ensayo Cel-1.
Abstract
La orientación de lesiones locales inducidas en genomas (TILLING) es una poderosa herramienta genética inversa que incluye mutagénesis química y detección de variación de secuencia en genes diana. TILLING es una herramienta de genómica funcional muy valiosa para la validación de genes, especialmente en granos pequeños en los que los enfoques basados en la transformación tienen serias limitaciones. Desarrollar una población mutageneizada robusta es clave para determinar la eficiencia de un estudio de validación de genes basado en TILLING. Una población de TILLING con una frecuencia de mutación general baja indica que se debe examinar una población imprácticamente grande para encontrar las mutaciones deseadas, mientras que una alta concentración de mutágenos conduce a una alta mortalidad en la población, lo que conduce a una número de individuos mutagenizados. Una vez que se desarrolla una población eficaz, hay múltiples maneras de detectar mutaciones en un gen de interés, y la elección de la plataforma depende de la escala experimental y la disponibilidad de recursos. El ensayo Cel-1 y el enfoque basado en gel de agarosa para la identificación de mutantes es conveniente, reproducible y una plataforma menos intensiva en recursos. Es ventajoso porque es simple, no requiere conocimientos computacionales, y es especialmente adecuado para la validación de un pequeño número de genes con equipos básicos de laboratorio. En el presente artículo, se describen los métodos para el desarrollo de una buena población TILLING, incluyendo la preparación de la curva de dosificación, mutagénesis y mantenimiento de la población mutante, y la detección de la población mutante utilizando el ensayo Cel-1 basado en PCR .
Introduction
Las mutaciones puntuales en los genomas pueden servir para muchos propósitos útiles para los investigadores. Dependiendo de su naturaleza y ubicación, estas mutaciones se pueden utilizar para asignar funciones a genes o incluso dominios distintos de proteínas de interés. Por otro lado, como fuente de nueva variación genética, se pueden seleccionar mutaciones útiles para los rasgos deseados utilizando pantallas de fenotipado y se pueden seguir utilizando en la mejora de los cultivos. TILLING es una poderosa herramienta de genética inversa que incluye mutagénesis química y detección de variación de secuencia en el gen objetivo. Desarrollado por primera vez en Arabidopsis1 y Drosophilia melanogaster2, las poblaciones de TILLING se han desarrollado y utilizado en muchos cultivos de grano pequeño como el trigo de pan hexaploide (Triticum aestivum)3, cebada (Hordeum vulgare)4, tetraploide de trigo duro (T. dicoccoides durum)5, trigo diploide (T. monococcum)6 y el genitor genoma “D” de trigo Aegilops tauschii7 . Estos recursos se han utilizado para validar las funciones de los genes en la regulación de la tolerancia al estrés abiótico y biótico8, la regulación del tiempo de floración9,y el desarrollo de variedades de cultivos nutricionalmente superiores5.
TILLING, junto con el uso de agentes mutagénicos altiladores como el metanoesulfonato etílico (EMS), azida sódica, N-metil-N-nitrosourea (MNU) y metanoesulfonato de metilo (MMS), tiene ventajas sobre otras herramientas genéticas inversas por varias razones. En primer lugar, la mutagénesis se puede llevar a cabo en prácticamente cualquier especie o variedad de la planta10 y es independiente del cuello de botella de transformación, que es particularmente difícil en el caso de los granos pequeños11. En segundo lugar, además de generar mutaciones noqueantes que pueden obtenerse mediante otros enfoques de validación genética, se puede inducir una serie de mutaciones erróneas y de empalme, que pueden discernir las funciones de los dominios individuales de las proteínas de interés12. Además, TILLING genera una colección inmortal de mutaciones a lo largo del genoma; por lo tanto, una sola población se puede utilizar para la validación funcional de múltiples genes. Por el contrario, otras herramientas de genética inversa generan recursos específicos sólo del gen en estudio13. Las mutaciones útiles identificadas a través de TILLING pueden desplegarse con fines de reproducción y no están sujetas a regulación, a diferencia de la edición genética, cuya clasificación no transgénica sigue siendo incierta en muchos países. Esto se vuelve especialmente relevante para los granos pequeños que se comercializan internacionalmente14.
TILLING es una estrategia de validación de genes simple y eficiente y requiere que se desarrollen poblaciones mutagenéticas para investigar genes de interés. El desarrollo de una población mutageneizada eficaz es clave para determinar la eficiencia de un estudio de validación de genes basado en TILLING. Una población de TILLING con una frecuencia de mutación global baja indica que una población imprácticamente grande debe ser examinada para detectar las mutaciones deseadas, mientras que una alta concentración de mutágenos conduce a una alta mortalidad en la población y un número insuficiente de individuos mutagenizados. Una vez que se desarrolla una buena población, hay múltiples maneras de detectar mutaciones en los genes de interés, y la elección de la plataforma depende de la escala experimental y la disponibilidad de recursos. La secuenciación del genoma entero y la secuenciación del exónima se ha utilizado para caracterizar todas las mutaciones en las poblaciones de TILLING en plantas con pequeños genomas15,16. La secuenciación de exomas de dos poblaciones DE TILLING se ha realizado en pan y trigo duro y está a disposición del público para identificar mutaciones deseables y ordenar líneas mutantes de interés17. Es un gran recurso público en términos de disponibilidad de mutaciones deseables; sin embargo, en los estudios de validación de genes, la línea de tipo silvestre debe poseer el gen candidato de interés. Desafortunadamente, sigue siendo prohibitivo secuenciar el exóme de toda la población de TILLING para la validación inversa basada en genética de unos pocos genes candidatos en otro contexto. La secuenciación de Amplicon y los ensayos basados en Cel-1 se han utilizado para detectar mutaciones en poblaciones específicas en trigo, y los ensayos Cel-1 son más simples, no requieren conocimientos computacionales, y son especialmente adecuados para la validación de un pequeño número de genes con equipo de laboratorio6,18.
En el presente artículo, se describen métodos para el desarrollo de una buena población TILLING, incluyendo la preparación de la curva de dosificación, mutagénesis y mantenimiento de la población mutante, y la detección de la población mutante utilizando el ensayo Cel-1 basado en PCR . Este protocolo ya se ha implementado con éxito en el desarrollo y la utilización de poblaciones mutagenizadas de Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, cebada, Aegilops tauchii7,y varios Otros. Se incluyen detalles explícitos de estos métodos junto con consejos útiles que ayudarán a los investigadores a desarrollar poblaciones de TILLING, utilizando EMS como mutágeno en cualquier planta de grano pequeño de elección.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING es una herramienta genética inversa muy valiosa para la validación de genes, especialmente para granos pequeños donde los enfoques basados en la transformación tienen serios cuellos de botella11. El desarrollo de una población mutageneizada con una alta frecuencia de mutación es uno de los pasos críticos en la realización de estudios de genómica funcional. El paso más importante en el desarrollo de una población robusta de TILLING es determinar la concentración óptima de EMS. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura del USDA, el proyecto Hatch 1016879 y la Estación Experimental Agrícola de Maryland a través de la Subvención MAES No. 2956952.
Materials
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
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