يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج ماوس يحمل الورم لمراقبة تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في الوقت الحقيقي عن طريق التصوير الغمر الحيوي المزدوج.
تكوين الأوعية الدموية، كعملية حاسمة من تطور الورم، أصبح نقطة ساخنة البحوث وهدفا للعلاج المضادة للورم. ومع ذلك، لا يوجد نموذج موثوق به لتتبع تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في وقت واحد بطريقة بصرية وحساسة. يعرض التصوير الإنارة الحيوية تفوقها الفريد في التصوير الحي بسبب مزاياه من الحساسية العالية، والخصوصية القوية، والقياس الدقيق. يقدم هنا بروتوكول لإنشاء نموذج الماوس الحاملة للورم عن طريق حقن رينلا لوسيفيراز المسمى خط خلية سرطان الثدي مورين 4T1 في الماوس المعدلة وراثيا مع الأوعية الدموية الناجمة عن التعبير اليراعة لوسيفيراز. يوفر نموذج الماوس هذا أداة قيمة لمراقبة تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في الوقت الحقيقي عن طريق التصوير ثنائي الإضاءة الحيوية في ماوس واحد. ويمكن تطبيق هذا النموذج على نطاق واسع في فحص الأدوية المضادة للورم وبحوث الأورام.
تكوين الأوعية هو عملية أساسية في تطور السرطان من الأورام الصغيرة المترجمة إلى أكبر، يحتمل أن تكون الأورام النقيلية1،2. يصبح الارتباط بين نمو الورم وتكوين الأوعية الدموية إحدى نقاط التركيز في مجال أبحاث الأورام. ومع ذلك، تفشل الطرق التقليدية لقياس التغيرات المورفولوجية في رصد تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في وقت واحد في الحيوانات الحية باستخدام نهج مرئي.
التصوير الإنارة الحيوية (BLI) من الخلايا السرطانية هو طريقة تجريبية مناسبة بشكل خاص لرصدنمو الورم بسبب عدم الغازية، والحساسية، والخصوصية 3،4،5،6 . وتستند تكنولوجيا BLI على مبدأ أن لوسيفيراز يمكن أن تحفز أكسدة الركيزة محددة في حين تنبعث منها الإنارة الحيوية. وluciferase أعرب في الخلايا السرطانية المزروعة يتفاعل مع الركيزة حقن، والتي يمكن الكشف عنها من قبل نظام التصوير الحي، وإشارات تعكس بشكل غير مباشر التغيرات في عدد الخلايا أو توطين الخلايا في الجسم الحي6،7.
باستثناء نمو الورم، يمكن أيضا تصور تكوين الأوعية الدموية الورم (الخطوة الحرجة في تطور السرطان) من خلال تكنولوجيا BLI باستخدام Vegfr2-Fluc-KI الفئران المعدلة وراثيا8،9،10. عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (Vegf) مستقبلات 2 (Vegfr2)، وهو نوع واحد من مستقبلات Vegf، وأعرب في الغالب في الخلايا البطانية الوعائية من الفئران الكبار11. في Vegfr2-Fluc-KI الفئران المعدلة وراثيا، يتم ضرب تسلسل الحمض النووي من لوسيفيراز اليراع (Fluc) في الطارد الأول من تسلسل Vegfr2 الذاتية. ونتيجة لذلك، يتم التعبير عن المداخن (التي تظهر كإشارات BLI) بطريقة مطابقة لمستوى تكوين الأوعية الدموية في الفئران. لتنمو أكثر من بضعة ملليمترات في الحجم، والورم يجند الأوعية الدموية الجديدة من الأوعية الدموية القائمة، والتي تعبر بشكل كبير عن Vegfr2 الناجمة عن عوامل النمو من الخلايا السرطانية1. وهذا يفتح إمكانية استخدام الفئران المعدلة وراثيا Vegfr2-Fluc-KI لمراقبة غير الغازية تكوين الأوعية الدموية الورم من قبل BLI.
في هذا البروتوكول، يتم إنشاء نموذج الماوس الحاملة للورم لرصد تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في ماوس واحد من خلال التصوير اليراعة لوسيفيراز (Fluc) ورينيلا لوسيفيراز (Rluc)، على التوالي (الشكل 1). يتم إنشاء خط خلية 4T1 (4T1-RR) الذي يعبر بشكل كبير عن بروتين الفلورسنت الأحمر وRluc (RFP) لتتبع نمو الخلايا عن طريق التصوير Rluc. لمزيد من التحقيق في التغيرات الديناميكية في تكوين الأوعية الدموية في تطور وتراجع الورم، يتم إنشاء خط خلية 4T1 آخر (4T1-RRT) الذي يعبر عن الانتحار الجينات الهربس البسيط فيروس اقتطاع كيناز الثيميدين (HSV-ttk)، Rluc، وRFP. بإدارة غانسيكلوفير (GCV)، يتم إلغاء الخلايا التعبير ية HSV-ttk بشكل انتقائي. استنادا ً إلى خطوط الخلايا هذه، تم بناء نموذج يحمل الورم في فئران Vegfr2-Fluc-KI التي تعمل كنموذج تجريبي لسد تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية الورم في الجسم الحي.
في هذا البروتوكول، يتم وصف نهج BLI المزدوج غير الغازية لرصد تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية. تم تطوير نظام مراسل BLI لأول مرة، الذي يحتوي على جين الانتحار HSV-ttk/GCV لتتبع تطور الورم والانحدار في الجسم الحي عن طريق التصوير Rluc. وفي الوقت نفسه، يتم تقييم تكوين الأوعية الدموية الورم باستخدام الفئ?…
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم هذا البحث من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFA0103200)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81671734)، والمشاريع الرئيسية لبرنامج تيانجين لدعم العلوم والتكنولوجيا (18YFZCSY00010)، وصناديق البحوث الأساسية ل الجامعات المركزية (63191155). نحن نعترف بمراجعات غلوريا نانس، التي كانت قيمة في تحسين نوعية مخطوطتنا.
0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
293T | ATCC | CRL-3216 | |
4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
Isoflurane | Baxter | 691477H | |
Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |