Imagen de bioluminiscencia dual de la progresión tumoral y la angiogénesis
Summary
Este protocolo describe el establecimiento de un modelo de ratón con tumores para monitorear la progresión tumoral y la angiogénesis en tiempo real mediante imágenes de bioluminiscencia dual.
Abstract
La angiogénesis, como un proceso crucial de progresión tumoral, se ha convertido en un punto crítico de investigación y objetivo de la terapia antitumoral. Sin embargo, no existe un modelo fiable para rastrear la progresión tumoral y la angiogénesis simultáneamente de una manera visual y sensible. Las imágenes de bioluminiscencia muestran su superioridad única en las imágenes vivas debido a sus ventajas de alta sensibilidad, fuerte especificidad y medición precisa. Aquí se presenta un protocolo para establecer un modelo de ratón con tumores mediante la inyección de una línea 4T1 de células de cáncer de mama murina con etiqueta de Renilla luciferasse en el ratón transgénico con expresión de luciferasa de luciérnaga inducida por angiogénesis. Este modelo de ratón proporciona una valiosa herramienta para monitorear simultáneamente la progresión tumoral y la angiogénesis en tiempo real mediante imágenes de bioluminiscencia dual en un solo ratón. Este modelo puede aplicarse ampliamente en la detección de fármacos antitumorales y la investigación oncológica.
Introduction
La angiogénesis es un proceso esencial en la progresión del cáncer de neoplasias pequeñas y localizadas a tumores más grandes y potencialmente metastásicos1,2. La correlación entre el crecimiento tumoral y la angiogénesis se convierte en uno de los puntos de énfasis en el campo de la investigación oncológica. Sin embargo, los métodos tradicionales para medir los cambios morfológicos no monitorean la progresión tumoral y la angiogénesis simultáneamente en animales vivos utilizando un enfoque visualizado.
La imagen de bioluminiscencia (BLI) de las células tumorales es un método experimental particularmente apropiado para controlar el crecimiento tumoral debido a su no invasividad, sensibilidad y especificidad3,4,5,6 . La tecnología BLI se basa en el principio de que la luciferasa puede catalizar la oxidación de un sustrato específico mientras emite bioluminiscencia. La luciferasa expresada en células tumorales implantadas reacciona con el sustrato inyectado, que puede ser detectado por un sistema de imágenes vivo, y las señales reflejan indirectamente los cambios en el número de células o localización celular in vivo6,7.
A excepción del crecimiento tumoral, la angiogénesis tumoral (el paso crítico en la progresión del cáncer) también se puede visualizar a través de la tecnología BLI utilizando ratones transgénicos Vegfr2-Fluc-KI8,9,10. El receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (Vegf), un tipo de receptor Vegf, se expresa principalmente en las células endoteliales vasculares de ratones adultos11. En los ratones transgénicos Vegfr2-Fluc-KI, la secuencia de ADN de La luciérnaga de luciérnaga (Fluc) se golpea en el primer exón de la secuencia endógena Vegfr2. Como resultado, el Fluc se expresa (que aparece como señales BLI) de una manera que es idéntica al nivel de angiogénesis en ratones. Para crecer más allá de unos pocos milímetros de tamaño, el tumor recluta nuevas vasculaturas de los vasos sanguíneos existentes, que expresan altamente el Vegfr2 desencadenado por factores de crecimiento de las células tumorales1. Esto abre la posibilidad de usar ratones transgénicos Vegfr2-Fluc-KI para monitorear no invasivamente la angiogénesis tumoral por BLI.
En este protocolo, se establece un modelo de ratón con tumores para monitorear la progresión tumoral y la angiogénesis en un solo ratón a través de la luciferasa de luciérnaga (Fluc) y la imagen de Renilla luciferase (Rluc), respectivamente (Figura1). Se crea una línea celular 4T1 (4T1-RR) que expresa establemente Rluc y proteína fluorescente roja (RFP) para rastrear el crecimiento celular por imágenes Rluc. Para investigar más a fondo los cambios dinámicos de la angiogénesis en la progresión y regresión del tumor, se crea otra línea celular 4T1 (4T1-RRT) que expresa el virus del herpes simple suicida truncado por timidasquina (HSV-ttk), Rluc y RFP. Mediante la administración de ganciclovir (GCV), las células que expresan el VHS-ttk se ablan selectivamente. Basado en estas líneas celulares, se construye un modelo de portador de tumores en ratones Vegfr2-Fluc-KI que sirve como un modelo experimental que une la progresión tumoral y la angiogénesis tumoral in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, se describe un enfoque de BLI dual no invasivo para monitorear el desarrollo tumoral y la angiogénesis. El sistema de reporteros bli se desarrolla por primera vez, que contiene el gen suicida HSV-ttk/GCV para rastrear la progresión del tumor y la regresión in vivo por imágenes Rluc. Mientras tanto, la angiogénesis tumoral se evalúa utilizando ratones Vegfr2-Fluc-KI a través de imágenes de Fluc. Este modelo de ratón con tumores es capaz de proporcionar una plataforma práctica para el desarroll…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el Programa Nacional Clave de I+D de China (2017YFA0103200), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81671734), y los Proyectos Clave del Programa de Apoyo a la Ciencia y Tecnología de Tianjin (18YFZCSY00010), Fondos De Investigación universidades centrales (63191155). Reconocemos las revisiones de Gloria Nance, que fueron valiosas para mejorar la calidad de nuestro manuscrito.
Materials
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
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