Dual Biolumineszenz-Bildgebung der Tumorprogression und Angiogenese
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines tumortragenden Mausmodells zur Überwachung der Tumorprogression und Angiogenese in Echtzeit durch duale Biolumineszenz-Bildgebung.
Abstract
Die Angiogenese als entscheidender Prozess der Tumorprogression ist zu einem Forschungs-Hotspot und Ziel der Anti-Tumor-Therapie geworden. Es gibt jedoch kein zuverlässiges Modell, um Tumorprogression und Angiogenese gleichzeitig visuell und sensibel zu verfolgen. Die Biolumineszenz-Bildgebung zeigt ihre einzigartige Überlegenheit in der lebendigen Bildgebung aufgrund ihrer Vorteile hoher Empfindlichkeit, starker Spezifität und genauer Messung. Präsentiert hier ist ein Protokoll, um ein tumortragendes Mausmodell zu etablieren, indem eine Renilla-Luziferase-markierte murine Brustkrebs-Zelllinie 4T1 in die transgene Maus mit Angiogenese-induzierter Firefly-Luzifferase-Expression injiziert wird. Dieses Mausmodell bietet ein wertvolles Werkzeug, um die Tumorprogression und Angiogenese in Echtzeit durch duale Biolumineszenz-Bildgebung in einer einzigen Maus zu überwachen. Dieses Modell kann weit verbreitet in Anti-Tumor-Arzneimittel-Screening und Onkologie-Forschung angewendet werden.
Introduction
Angiogenese ist ein wesentlicher Prozess bei der Progression von Krebs von kleinen, lokalisierten Neoplasmen zu größeren, potenziell metastasierenden Tumoren1,2. Die Korrelation zwischen Tumorwachstum und Angiogenese wird zu einem der Schwerpunkte im Bereich der onkologischen Forschung. Herkömmliche Methoden zur Messung morphologischer Veränderungen können jedoch die Tumorprogression und Angiogenese bei lebenden Tieren nicht gleichzeitig mit einem visualisierten Ansatz überwachen.
Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) von Tumorzellen ist eine besonders geeignete experimentelle Methode zur Überwachung des Tumorwachstums aufgrund seiner Nicht-Invasivität, Empfindlichkeit und Spezifität3,4,5,6 . Die BLI-Technologie basiert auf dem Prinzip, dass die Luziferase die Oxidation eines bestimmten Substrats katalysieren kann, während sie Diebiomineszenz aussendet. Die in implantierten Tumorzellen exprimierte Luziferase reagiert mit dem injizierten Substrat, das durch ein lebendiges Bildgebungssystem nachgewiesen werden kann, und Signale spiegeln indirekt die Veränderungen der Zellzahl oder Zelllokalisierung in vivo6,7wider.
Abgesehen vom Tumorwachstum kann die Tumorangiogenese (der kritische Schritt in der Krebsprogression) auch durch BLI-Technologie mit Vegfr2-Fluc-KI transgenen Mäusen8,9,10visualisiert werden. Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (Vegf) Rezeptor 2 (Vegfr2), eine Art Von Vegf-Rezeptor, wird meist in den vaskulären Endothelzellen von erwachsenen Mäusen11exprimiert. Bei transgenen Vegfr2-Fluc-KI-Mäusen wird die DNA-Sequenz der Firefly-Luziferase (Fluc) in das erste Exon der endogenen Vegfr2-Sequenz geschlagen. Als Ergebnis wird der Fluc (der als BLI-Signale erscheint) in einer Weise ausgedrückt, die mit dem Niveau der Angiogenese bei Mäusen identisch ist. Um über ein paar Millimeter zu wachsen, rekrutiert der Tumor neue Gefäße aus bestehenden Blutgefäßen, die die durch Wachstumsfaktoren aus den Tumorzellen1ausgelöste Vegfr2 stark ausdrücken. Dies eröffnet die Möglichkeit, vegfr2-Fluc-KI transgene Mäuse zu verwenden, um die Tumorangiogenese durch BLI nicht-invasiv zu überwachen.
In diesem Protokoll wird ein tumortragendes Mausmodell zur Überwachung der Tumorprogression und Angiogenese in einer einzigen Maus durch Firefly luciferase (Fluc) bzw. Renilla luciferase (Rluc) Bildgebung eingerichtet (Abbildung 1). Es entsteht eine 4T1-Zelllinie (4T1-RR), die Rluc und rotes fluoreszierendes Protein (RFP) stabil ausdrückt, um das Zellwachstum durch Rluc-Bildgebung zu verfolgen. Um die dynamischen Veränderungen der Angiogenese in der Progression und Regression des Tumors weiter zu untersuchen, wird eine weitere 4T1-Zelllinie (4T1-RRT) erstellt, die Selbstmord-Genherpes simplex-Virus abgeschnittene Thymidinkinase (HSV-ttk), Rluc und RFP ausdrückt. Durch die Verabreichung von Ganciclovir (GCV) werden die HSV-ttk-Exemitzellen selektiv ablated. Basierend auf diesen Zelllinien wird ein tumortragendes Modell in Vegfr2-Fluc-KI-Mäusen entwickelt, das als experimentelles Modell dient, das die Tumorprogression und Tumorangiogenese in vivo überbrückt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll wird ein nicht-invasiver dualer BLI-Ansatz zur Überwachung der Tumorentwicklung und Angiogenese beschrieben. Das BLI-Reportersystem wurde entwickelt und enthält das HSV-ttk/GCV-Selbstmordgen zur Verfolgung der Tumorprogression und Regression in vivo durch Rluc-Bildgebung. In der Zwischenzeit wird die Tumorangiogenese mit Vegfr2-Fluc-KI-Mäusen mittels Fluc-Bildgebung untersucht. Dieses tumortragende Mausmodell ist in der Lage, eine praktische Plattform für die kontinuierliche und nicht-invasive Tra…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde unterstützt durch das National Key R&D Program of China (2017YFA0103200), die National Natural Science Foundation of China (81671734) und Key Projects of Tianjin Science and Technology Support Program (18YFZCSY00010), Fundamental Research Funds for den Zentraluniversitäten (63191155). Wir erkennen die Revisionen der Gloria Nance an, die für die Verbesserung der Qualität unseres Manuskripts wertvoll waren.
Materials
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
References
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