הדמיה ביולומינסנציה כפולה של התקדמות הגידול ואנגיוגנזה
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הקמתה של המודל הנושא הגידול העכבר כדי לפקח על התקדמות הגידול ואנגיוגנזה בזמן אמת על ידי הדמיה ביולומינציה כפול.
Abstract
אנגיוגנזה, כתהליך מכריע של התקדמות הגידול, הפך נקודה חמה מחקר היעד של טיפול נגד הגידול. עם זאת, אין מודל אמין לעקיבה אחר התקדמות הגידול ואנגיוגנזה בו באופן חזותי ורגיש. הדמיה ביולומינסנציה מציגה את עליונותה הייחודית בהדמיית חיים בשל יתרונותיה של רגישות גבוהה, ספציפיות ומדידה מדויקת. הציג כאן הוא פרוטוקול כדי להקים מודל הנושא הגידול העכבר על ידי הזרקת Renilla לוציפראז התווית מורטין סרטן השד קו 4T1 לתוך העכבר טרנסגניים עם המושרה אנגיוגנזה הבעה לוציפראז. מודל זה של העכבר מספק כלי יקר ערך בו לפקח על התקדמות הגידול ואנגיוגנזה בזמן אמת על ידי הדמיה ביולומינציה כפול בעכבר בודד. מודל זה עשוי להיות נרחב להחיל הקרנת תרופות נגד הגידול ואונקולוגיה מחקר.
Introduction
אנגיוגנזה הוא תהליך חיוני בהתקדמות של סרטן מ קטן, ניפלאמים מקומיים לגדול, פוטנציאל גידולים גרורות1,2. הקורלציה בין צמיחת הגידול והאנגיוגנזה הופכת לאחת מנקודות ההדגשה בתחום המחקר האונקולוגי. עם זאת, שיטות מסורתיות של מדידת שינויים מורפולוגיים לא לפקח על התקדמות הגידול ואנגיוגנזה בו זמנית בחיות חיים באמצעות גישה דמיינו.
ביולומינסנציה הדמיה (בלי) של תאים סרטניים היא שיטה ניסויית המתאימה במיוחד כדי לפקח על צמיחת הגידול בגלל החלטיות שלה לא פולשני, רגישות, וספציפיות3,4,5,6 . טכנולוגיית בלי מבוססת על העיקרון כי לוציפראז יכול לזרז חמצון של מצע ספציפי תוך פליטת ביולומינציה. ללוציפראז הביע בתאי הגידול מושתל מגיב עם המצע מוזרק, אשר ניתן לזהות על ידי מערכת הדמיה חיה, אותות בעקיפין לשקף את השינויים מספר התא או לוקליזציה תא ב vivo6,7.
למעט צמיחת הגידול, הגידול אנגיוגנזה (הצעד הקריטי בהתקדמות הסרטן) יכול גם להיות מדמיין דרך הטכנולוגיה בלי להשתמש בעכבר Vegfr2-fluc-KI הטרנסגניים8,9,10. מקדם הצמיחה של כלי הדם (הקולטן) 2 (Vegfr2), סוג אחד של קולטן, מתבטא בעיקר בתאי כלי הדם של עכברים למבוגרים11. ב-Vegfr2-Fluc-KI העכברים, רצף ה-DNA של גחלילית לוציפראז (Fluc) הוא דפק לתוך האקסון הראשון של הרצף האנדודוגני Vegfr2. כתוצאה מכך, ה-Fluc מתבטא (המופיעה כאותות בלי מלים) באופן זהה לרמת האנגיוגנזה בעכברים. כדי לצמוח מעבר כמה מילימטרים בגודל, הגידול מגייס ואסיקולטרים חדשים מכלי הדם הקיימים, אשר מאוד לבטא את Vegfr2 המופעל על ידי גורמי גדילה מתאי הגידול1. זה פותח את האפשרות של שימוש Vegfr2-Fluc-KI העכברים הטרנסגניים כדי שאינו פולשני לפקח על אנגיוגנזה הגידול על ידי בלי.
בפרוטוקול זה, מודל העכבר נושאת הגידול הוא הוקם כדי לפקח על התקדמות הגידול ואנגיוגנזה בעכבר אחד באמצעות לוציו גחלילית (fluc) ו renilla ללוציפראז (rluc) הדמיה, בהתאמה (איור 1). קו תא 4T1 (4T1-RR) נוצר באופן מאוד מבטא Rluc וחלבון פלורסנט אדום (RLUC) כדי לעקוב אחר צמיחת תאים על ידי הדמיה Rluc. כדי לחקור עוד יותר את השינויים הדינמיים של אנגיוגנזה בהתקדמות ורגרסיה של הגידול, קו תא 4t1 נוסף (4t1-rrt) נוצר כי המבטא התאבדות גן הרפס וירוס מעוגל תימידין קינאז (HSV-ttk), rrt, ו-rrt. על-ידי המינהל של ganciclovir (GCV), את HSV-ttk המבטא תאים הם באופן סלקטיבי הקשורים. בהתבסס על קווי תאים אלה, מודל הנושאת גידול בעכברים Vegfr2-Fluc-KI בנוי המשמש כמודל ניסיוני גישור התקדמות הגידול והגידול אנגיוגנזה בvivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, הגישה ללא פולשני כפול מתואר מחוץ לתחום הפיתוח של הגידול והאנגיוגנזה. מערכת העיתונאי בלי להיות מפותח לראשונה, המכיל את הגן HSV-ttk/GCV התאבדות עבור מעקב התקדמות הגידול ורגרסיה ב vivo ידי Rluc הדמיה. בינתיים, הגידול אנגיוגנזה מוערך באמצעות Vegfr2-Fluc-KI עכברים באמצעות הדמיה Fluc. זה הגידול מוד?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מפתח לאומי R & D של סין (2017YFA0103200), הלאומי המדע הטבעי הקרן של סין (81671734), ופרויקטים מרכזיים של טיינג’ין המדע וטכנולוגיה תוכנית תמיכה (18YFZCSY00010), קרנות המחקר הבסיסי עבור האוניברסיטאות המרכזיות (63191155). אנו מכירים בשינויים של גלוריה נאנס, שהיו יקרי ערך בשיפור איכות כתב היד שלנו.
Materials
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
References
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).
- Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC. Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).
- Wang, R., et al. Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence. Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).
- Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. Tumor angiogenesis, from foe to friend. Science. 349, 694-695 (2015).
- Zhang, K., et al. Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment. ACS Applied Materials & Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. , 70-81 (2017).
- Lee, S., et al. Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis. Cell. 130, 691-703 (2007).
- Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response. Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).
- Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 152-169 (2016).
- Wong, P. P., et al. Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread. Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).
- Mezzanotte, L., van 't Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications. Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).
- Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy. Biochimie. 116, 43-51 (2015).
- Liu, J., et al. Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).
- Branchini, B. R., et al. Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments. Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).
- McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing "red-shifted" luciferase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).
