عزل الخلايا أحادية اللامينا بروبريا أحادية النونافة من القولون المورين باستخدام Collagenase E
Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو عزل الخلايا أحادية النووية التي توجد في بروبريا لامينا القولون عن طريق الهضم الأنزيمي للأنسجة باستخدام الكولاجين. يسمح هذا البروتوكول بعزل الخلايا أحادية النووية بكفاءة مما يؤدي إلى تعليق خلية واحدة والتي بدورها يمكن استخدامها للنماذج المناعية القوية.
Abstract
الأمعاء هي موطن لأكبر عدد من الخلايا المناعية في الجسم. أجهزة المناعة المعوية الصغيرة والكبيرة الشرطة التعرض للمستضدات الخارجية وتعديل الاستجابات للمحفزات المناعية المستمدة من الميكروبات قوية. لهذا السبب، الأمعاء هي موقع الهدف الرئيسي من خلل التنظيم المناعي والتهاب في العديد من الأمراض بما في ذلك، ولكن، لا تقتصر على أمراض الأمعاء الالتهابية مثل مرض كرون والتهاب القولون التقرحي، ومرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GVHD) بعد العظام زرع نخاع (BMT)، والعديد من الحالات التحسسية والمعدية. وتستخدم نماذج مورين من التهاب الجهاز الهضمي والتهاب القولون بشكل كبير لدراسة مضاعفات GI ولتحسين استراتيجيات ما قبل السريرية للوقاية والعلاج. البيانات التي تم جمعها من هذه النماذج عن طريق العزلة والتحليل الفينوتي للخلايا المناعية من الأمعاء أمر بالغ الأهمية لمزيد من الفهم المناعي التي يمكن تطبيقها لتحسين اضطرابات الجهاز الهضمي والالتهابات الجهازية. يصف هذا التقرير بروتوكولًا عالي الفعالية لعزل الخلايا أحادية النووية (MNC) عن القولون باستخدام واجهة تدرج تدرج ية مختلطة قائمة على السيليكا. هذه الطريقة reproducibly يعزل عددا كبيرا من الكريات البيض قابلة للحياة مع التقليل من تلوث الحطام، مما يسمح اللاحقة الفينول المناعي عن طريق قياس التدفق الخلوي أو غيرها من الأساليب.
Introduction
على الرغم من أن الجهاز الهضمي (GI) مخصص في المقام الأول لمعالجة وإعادة امتصاص المواد الغذائية من المواد الغذائية، فإن الجهاز الهضمي يحافظ أيضا على أدوار مركزية في سلامة الأوعية الدموية، اللمفاوية، والجهاز العصبي والعديد من الأجهزة الأخرى من خلال في الغشاء المخاطي والجهاز المناعي تحت المخاطية1. الجهاز المناعي GI له دور مؤثر في كل من الجهاز الهضمي والصحة الجهازية بسبب تعرضه المستمر للمستضدات الأجنبية من الغذاء، والبكتيريا commensal، أو مسببات الأمراض الغازية1،2. وهكذا، يجب على الجهاز المناعي GI الحفاظ على توازن دقيق الذي يتسامح مع المستضدات غير المسببة للأمراض في حين تستجيب بشكل مناسب للمستضدات المسببة للأمراض1،2. عندما يتم تعطيل توازن التسامح والدفاع، يمكن أن يحدث خلل التنظيم المناعي الموضعي أو الجهازي والالتهاب مما يؤدي إلى عدد لا يحصى من الأمراض1،2،3.
الأمعاء تأوي ما لا يقل عن 70٪ من جميع الخلايا اللمفاوية في الجسم4. معظم التفاعلات المناعية الأولية تنطوي على واحدة على الأقل من ثلاث محطات المناعة في الأمعاء: 1) بقع باير، 2) الخلايا الليمفاوية داخل الظهارة (IEL) و 3) الخلايا الليمفاوية لامينا بروبريا (LPL). يتكون كل من هذه من شبكة معقدة مترابطة من الخلايا المناعية التي تستجيب بسرعة للتحديات المناعية الطبيعية في الأمعاء5. يقتصر على ستروما فوق الغشاء المخاطي العضلي، وpropria لامينا منظم بشكل فضفاض هو النسيج الضام من الغشاء المخاطي للمعوة الأمعاء ويشمل السقالات للزغب، والأوعية الدموية، والصرف اللمفاوي، والجهاز العصبي المخاطي، فضلا عن العديد من الفطرية والمجموعات الفرعية المناعيةالتكيفية6و7و8و9. وتتألف LPL من CD4+ وCD8+ T الخلايا في نسبة تقريبية من 2:1، خلايا البلازما وخلايا النسب النخاعي بما في ذلك، الخلايا التقشرية، والخلايا الصاري، الحمضات والضامة6.
هناك اهتمام متزايد في فهم خلل التنظيم المناعي والتهاب الأمعاء لأنها تتعلق بحالات المرض المختلفة. مثل أمراض كرون والتهاب القولون التقرحي كل ذلك يظهر مستويات متفاوتة من التهاب القولون10،11،12. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرضى الذين يعانون من اضطرابات خبيثة أو غير خبيثة في النخاع أو الجهاز المناعي الذين يخضعون لزراعة نخاع العظم الالوجيني (allo-BMT) تطوير أشكال مختلفة من التهاب القولون بما في ذلك 1) السمية المباشرة من أنظمة تكييف قبل BMT، 2) العدوى الناجمة عن كبت المناعة بعد BMT و 3) الكسب غير المشروع مقابل مرض المضيف (GVHD) مدفوعا الخلايا T من النوع المانح ة رد فعل على المستضدات المانحة في الأنسجة بعد BMT13،14،15. كل هذه المضاعفات ما بعد BMT يؤدي إلى تغييرات كبيرة في الوسط المناعي للأمعاء16،17،18. تسمح الطريقة المقترحة بتقييم يمكن الاعتماد عليه لتراكم الخلايا المناعية في القولون الفأر، وعندما تطبق على متلقي المورين بعد BMT، تسهل فحص كفاءة لكل من الخلايا المناعية المانحة والمتلقية المشاركة في تحمل زرع19 ،20. وتشمل الأسباب الإضافية لالتهاب الأمعاء الأورام الخبيثة، والحساسية الغذائية، أو اضطراب ميكروبيوم الأمعاء. يسمح هذا البروتوكول بالوصول إلى الخلايا أحادية النووية في الأمعاء من القولون، ومع التعديلات، إلى الكريات البيض في الأمعاء الدقيقة في أي من هذه النماذج المارين قبل السريرية.
بحث PubMed باستخدام مصطلحات البحث “الأمعاء والخلية المناعية والعزلة” يكشف أكثر من 200 منشورات تصف أساليب هضم الأمعاء الدقيقة لاستخراج الخلايا المناعية. ومع ذلك، فإن البحث عن الأدب مماثلة للقولون لا تسفر عن بروتوكولات محددة جيدا تحديد عزل الخلايا المناعية من القولون. قد يكون هذا لأن القولون لديه طبقات أكثر العضلات والخلالية، مما يجعل من الصعب هضم تماما من الأمعاء الدقيقة. على عكس البروتوكولات القائمة، يستخدم هذا البروتوكول على وجه التحديد كولاجيناز E من الهتستيك Clostridium دون الكولاجين البكتيرية الأخرى (Collagenase D / Collagenase I). نحن نثبت أنه، باستخدام هذا البروتوكول، يمكن تحقيق هضم الأنسجة القولونية مع الحفاظ على نوعية الخلايا المناعية أحادية النووية الأمعاء المعزولة (MNC) دون إضافة الكواشف المضادة للتكتل مثل فيرسنال الصوديوم (EDTA)، Dispase II، و ديوكسيريبونوكليس 1 (DNAse I)21،22،23. تم تحسين هذا البروتوكول للسماح باستخراج قوي قابل للاستنساخ من MNC قابلة للحياة من القولون مورين لمزيد من الدراسات الموجهة، وينبغي أن تصلح لدراسة المناعة من القولون أو (مع التعديلات) الأمعاء الدقيقة24، 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول البصري الأساليب التي يمكن تحملها بشكل جيد لعزل الخلايا أحادية النووية القولونية بما في ذلك الخلايا الليمفاوية لامينا بروبريا (LPL). وبالنظر إلى أن هذا البروتوكول تم تحسينه في تقييم نماذج التهاب القولون الماوس بعد زرع شديدة حيث السيتوكينات الالتهابية وإصابة الأنسجة تصلح…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح #1K08HL088260 و #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) ومؤسسة Batchelor لبحوث الأطفال (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 وBALB / ج الفئران المستخدمة في هذه الدراسة إما ولدت في منشأتنا أو المقدمة من مختبرات جاكسون أو تاكونيك.
Materials
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18- gauge Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 micrometer pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
References
- Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
- Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
- Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
- Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
- Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
- Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
- Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
- Harb, W. J. Crohn’s Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
- Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
- Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
- Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
- Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
- Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
- Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
- Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
- Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
- van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
- Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
- Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
- Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases – A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
- Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- van der Heijden, P. j., Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).
