Isolatie van lamina propria mononucleaire cellen van Murine Colon met behulp van Collagenase E
Summary
Het doel van dit protocol is het isoleren van mononucleaire cellen die zich in de lamina propria van de dikke darm bevinden door enzymatische vertering van het weefsel met collagenase. Dit protocol maakt een efficiënte isolatie van mononucleaire cellen mogelijk, wat resulteert in een enkelvoudige celsuspensie die op zijn beurt kan worden gebruikt voor robuuste immunophenotypering.
Abstract
De darm is de thuisbasis van het grootste aantal immuuncellen in het lichaam. De kleine en grote intestinale immuun systemen politie blootstelling aan exogene antigenen en moduleren reacties op krachtige microbieel afgeleide immuun stimuli. Om deze reden, de darm is een belangrijke doelsite van immuun disregulatie en ontsteking bij vele ziekten, met inbegrip van maar, niet beperkt tot inflammatoire darmziekten zoals de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa, transplantaat-versus-host ziekte (GVHD) na bot beenmergtransplantatie (BMT), en vele allergische en infectieuze aandoeningen. Murine modellen van gastro-intestinale ontsteking en colitis worden intensief gebruikt voor het bestuderen van GI complicaties en vooraf klinisch optimaliseren strategieën voor preventie en behandeling. Gegevens uit deze modellen via isolatie en fenotypische analyse van immuuncellen uit de darm is van cruciaal belang voor verder immuun begrip dat kan worden toegepast op het verzachten van gastro-intestinale en systemische inflammatoire aandoeningen. Dit rapport beschrijft een zeer effectief protocol voor de isolatie van mononucleaire cellen (MNC) van de dikke darm met behulp van een gemengde dichtheidsgradiënt interface op basis van silica. Deze methode reproduceert een significant aantal levensvatbare leukocyten, terwijl het contaminerende vuil minimaliseert, waardoor daaropvolgende immuunfenotyping door Flowcytometrie of andere methoden mogelijk is.
Introduction
Hoewel de gastro-intestinale (GI) tractus is voornamelijk gewijd aan de verwerking en reabsorptie van voedingsstoffen uit voedsel, het GI-tractus onderhoudt ook centrale rollen in de integriteit van de vasculaire, lymfatische, en zenuwstelsel en van tal van andere organen via het mucosale en submucosale immuunsysteem1. Het GI-immuunsysteem heeft een invloedrijke rol in zowel de gastro-intestinale en systemische gezondheid als gevolg van de constante blootstelling aan buitenlandse antigenen uit voedsel, commensale bacteriën, of binnenvallende pathogenen1,2. Zo moet het GI-immuunsysteem een delicaat evenwicht behouden waarin het niet-pathogene antigenen tolereert terwijl het adequaat reageert op pathogene antigenen1,2. Wanneer de balans van tolerantie en verdediging wordt verstoord, gelokaliseerde of systemische immuun disregulatie en ontsteking kan optreden resulterend in een groot aantal ziekten1,2,3.
De darm herbergt ten minste 70% van alle lymfoïde cellen in het lichaam4. De meeste primaire immunologische interacties betreffen ten minste één van de drie immuunstations in de darm: 1) Peyer’s patches, 2) Intraepitheliale lymfocyten (IEL) en 3) lamina propria lymfocyten (LPL). Elk van deze bestaat uit een complex verbonden netwerk van immuuncellen die snel reageren op normale immuunproblemen in de darm5. Beperkt tot de stroma boven de Muscularis mucosae, de losjes gestructureerde lamina propria is het bindweefsel van het darm slijmvlies en omvat steigers voor de villus, de vasculatuur, lymfedrainage, en mucosale zenuwstelsel, evenals vele aangeboren en adaptieve immune deelverzamelingen6,7,8,9. LPL bestaat uit CD4+ -en CD8+ T-cellen in een geschatte verhouding van 2:1, plasmacellen en myeloïde Lineage cellen, waaronder dendritische cellen, mestcellen, eosinofielen en macrofagen6.
Er is een groeiende belangstelling voor het begrijpen van de immuun disregulatie en ontsteking van de darm als het betrekking heeft op verschillende ziektetoestanden. Dergelijke aandoeningen als de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa manifesteren alle verschillende niveaus van Colon ontsteking10,11,12. Bovendien kunnen patiënten met maligne of niet-maligne aandoeningen van het merg of het immuunsysteem die een allogene beenmergtransplantatie ondergaan (Allo-BMT) verschillende vormen van colitis ontwikkelen, waaronder 1) directe toxiciteit van conditionerings regimes vóór BMT, 2) infecties veroorzaakt door immunosuppressie na BMT en 3) Graft-versus-hostziekte (gvhd) die wordt aangedreven door donor-type T cellen die reageren op donor Allo-antigenen in de weefsels na BMT13,14,15. Al deze complicaties na BMT resulteren in significante veranderingen in het immuunmilieu van de darmen16,17,18. De voorgestelde methode maakt een betrouwbare beoordeling van de accumulatie van immune cellen in de muis Colon mogelijk en, wanneer toegepast op muriene ontvangers na BMT, vergemakkelijkt een efficiënte assay van zowel donor-als ontvangende immuuncel die betrokken zijn bij transplantatie tolerantie19 ,20. Extra oorzaken van ontsteking van de darm zijn maligniteiten, voedselallergieën, of verstoring van het microbioom van de darmen. Dit protocol biedt toegang tot de darm mononucleaire cellen van de dikke darm en, met wijzigingen, aan leukocyten van de dunne darm in een van deze preklinische Murine modellen.
Een PubMed zoeken met behulp van de zoektermen “darm en immune cel en isolatie” onthult meer dan 200 publicaties beschrijven methoden voor de spijsvertering van de dunne darm om immune cellen te extraheren. Echter, een soortgelijke literatuur zoeken naar Colon levert geen goed afgebakende protocollen specificeren isolatie van immune cellen van de dikke darm. Dit kan zijn omdat de dikke darm meer gespierde en interstitiële lagen heeft, waardoor het moeilijker om volledig te verteren dan de dunne darm. In tegenstelling tot bestaande protocollen, gebruikt dit protocol specifiek Collagenase E van Clostridium histolyticum zonder andere bacteriële collagenasen (Collagenase D/Collagenase I). We tonen aan dat, met behulp van dit protocol, de vertering van het Colon weefsel kan worden bereikt met behoud van de kwaliteit van geïsoleerde gut mononucleaire immuuncellen (MNC) zonder toevoeging van anti klonter reagentia zoals natrium versenate (EDTA), Dispase II, en deoxyribonuclease i (DNase i)21,22,23. Dit protocol is geoptimaliseerd om toe te staan reproduceerbare robuuste extractie van levensvatbaar MNC van de Murine Colon voor verdere gerichte studies en moet zich lenen voor de studie van immunologie van de dikke darm of (met modificaties) de dunne darm24, 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit visuele protocol beschrijft goed getolereerde methoden voor de isolatie van Colon mononucleaire cellen, waaronder lamina propria lymfocyten (LPL). Gezien het feit dat dit protocol is geoptimaliseerd in de evaluatie van ernstige post-transplantatie muis colitis modellen waar inflammatoire cytokines en weefsel letsel lenen zich voor een slechte levensvatbaarheid van teruggewonnen MNC, we verwachten dat deze methoden kunnen worden vertaald naar andere toepassingen die fenotypische analyse van Colon MNC vereisen. Deze om…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies #1K08HL088260 en #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), en de Batchelor Foundation voor pediatrisch onderzoek (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 en BALB/c muizen die in deze studie werden gebruikt, werden ofwel gefokt in onze faciliteit of geleverd door Jackson Labs of Taconic.
Materials
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18- gauge Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 micrometer pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
References
- Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
- Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
- Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
- Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
- Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
- Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
- Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
- Harb, W. J. Crohn’s Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
- Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
- Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
- Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
- Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
- Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
- Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
- Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
- Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
- van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
- Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
- Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
- Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases – A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
- Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- van der Heijden, P. j., Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).
