Målet med denne protokollen er å isolere mononukleære celler som ligger i lamina propria i tykktarmen ved enzymatisk fordøyelse av vevet ved hjelp av kollagenase. Denne protokollen gjør det mulig for effektiv isolering av mononukleære celler som resulterer i en enkelt celle suspensjon som i sin tur kan brukes til robuste immunfenotyping.
Tarmen er hjemmet til det største antall immunceller i kroppen. Det liten og stor intestinal immun systemer politiet avsøring å eksogene antigener og modulere Svar å potent mikrobielt avledet immun stimuli. Av denne grunn er tarmen et viktig målområde for immun feilregulering og betennelse i mange sykdommer, inkludert men, ikke begrenset til inflammatoriske tarm sykdommer som Crohns sykdom og ulcerøs kolitt, pode-versus-host sykdom (GVHD) etter bein marg transplantasjon (BMT), og mange allergiske og smittsomme tilstander. Murine-modeller av gastrointestinal betennelse og kolitt er mye brukt til å studere GI komplikasjoner og til pre-klinisk optimalisere strategier for forebygging og behandling. Data samlet fra disse modellene via isolasjon og fenotypiske analyse av immunceller fra tarmen er avgjørende for ytterligere immun forståelse som kan anvendes for å forbedre Gastrointestinal og systemiske inflammatoriske lidelser. Denne rapporten beskriver en svært effektiv protokoll for isolering av mononukleære celler (MNC) fra kolon ved hjelp av en blandet silica-basert tetthet gradient grensesnitt. Denne metoden reproduserbar isolerer et betydelig antall levedyktige leukocytter samtidig minimere forurensende rusk, slik at påfølgende immune bestemmelse av fenotype ved flyt flowcytometri eller andre metoder.
Selv om Gastrointestinal (GI)-kanalen er primært dedikert til behandling og reabsorpsjon av næringsstoffer fra mat, opprettholder GI veiene også sentrale roller i integriteten av vaskulære, lymfatisk, og nervøse systemer og av mange andre organer gjennom sin slimhinne og submucosal immunsystem1. GI immune systemet har en innflytelsesrik rolle i både Gastrointestinal og systemisk helse på grunn av sin konstante eksponering for utenlandske antigener fra mat, Commensal bakterier, eller invadere patogener1,2. Dermed må gi immunforsvaret opprettholde en delikat balanse der det tåler ikke-patogene antigener mens svarer hensiktsmessig til patogene antigener1,2. Når balansen av toleranse og forsvar er forstyrret, lokaliserte eller systemisk immune feilregulering og betennelse kan oppstå som resulterer i en myriade av sykdommer1,2,3.
Tarmen havner minst 70% av alle lymfoide celler i kroppen4. De fleste primære Immunologic interaksjoner innebære minst én av tre uimottakelig stasjoner i tarmen: 1) Peyer ‘ s patcher, 2) intraepithelial-lymfocytter (IEL) og 3) lamina propria-lymfocytter (LPL). Hver av disse består av et komplekst sammenhengende nettverk av immunceller som raskt reagerer på normale immun utfordringer i tarmen5. Begrenset til stroma over muscularis mucosae, løst strukturert lamina propria er bindevev i tarmen mucosa og inkluderer stillas for villus, den blodkar, lymfatisk drenering, og slimhinnen nervesystemet, samt mange medfødt og adaptive immune undergrupper6,7,8,9. LPL består av CD4+ og CD8+ T celler i et omtrentlig forhold på 2:1, plasma celler og myelogen avstamning celler inkludert, dendrittiske celler, mastceller, eosinofile og makrofager6.
Det er en økende interesse i å forstå immun feilregulering og betennelse i tarmen som det gjelder ulike sykdomstilstander. Slike forhold som Crohns sykdom og ulcerøs kolitt manifesterer alle varierende nivåer av colonic betennelse10,11,12. I tillegg kan pasienter med ondartede eller ikke-ondartede forstyrrelser i margen eller immunsystemet som gjennomgår en allogene benmarg transplantasjon (Allo-BMT) utvikle ulike former for kolitt inkludert 1) direkte toksisitet fra condition regimer før BMT, 2) infeksjoner forårsaket av immunsuppresjon etter BMT og 3) pode-versus-host sykdom (GVHD) drevet av donor-type T-celler reagerer på donor Allo-antigener i vevet etter BMT13,14,15. Alle disse post-BMT komplikasjoner resultere i betydelige endringer i immun miljøet i tarmen16,17,18. Den foreslåtte metoden gjør det mulig for en pålitelig vurdering av immun celle akkumulering i musen kolon, og når den brukes til murine mottakere etter BMT, forenkler en effektiv analyse av både donor og mottaker immunceller involvert i transplantasjon toleranse19 ,20. Ytterligere årsaker til tarmbetennelse inkluderer ondartet, matallergier, eller forstyrrelse av tarmen mikrobiomet. Denne protokollen gir tilgang til gut mononukleære celler fra kolon og, med modifikasjoner, til leukocytter av tynntarmen i noen av disse prekliniske murine modeller.
En PubMed søk ved hjelp av søkeordene “tarmen og immun celle og isolasjon” avslører over 200 publikasjoner som beskriver metoder for tynntarmen fordøyelsen å trekke ut immunceller. Men en lignende litteratursøk for kolon gir ingen godt avgrenset protokoller spesifisere isolering av immunceller fra kolon. Dette kan være fordi kolon har mer muskuløse og interstitiell lag, rendering det vanskeligere å fullstendig fordøye enn tynntarmen. I motsetning til eksisterende protokoller, bruker denne protokollen spesifikt Kollagenase E fra histolyticum uten andre bakterielle Collagenases (kollagenase D/kollagenase I). Vi viser at ved hjelp av denne protokollen, fordøyelsen av colonic vev kan oppnås samtidig bevare kvaliteten på isolerte gut mononukleære immunceller (MNC) uten tilsetning av anti-klumper reagenser som natrium versenate (EDTA), Dispase II, og deoxyribonuclease i (DNAse i)21,22,23. Denne protokollen er optimalisert for å tillate reproduserbar robust utvinning av levedyktige MNC fra murine kolon for videre rettet studier og bør låne seg til studiet av immunologi av kolon eller (med modifikasjoner) i tynntarmen24, 25på.
Denne visuelle protokollen beskriver godt tolerert metoder for isolering av colonic mononukleære celler inkludert lamina propria lymfocytter (LPL). Gitt at denne protokollen ble optimalisert i å evaluere alvorlig post-transplantasjon mus kolitt modeller hvor inflammatorisk cytokiner og vevsskade egner seg til dårlig levedyktighet av utvinnes MNC, forventer vi at disse metodene kan oversettes til andre applikasjoner som krever fenotypiske analyse av colonic MNC. Disse inkluderer, men, er ikke begrenset til å vurdere k…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd #1K08HL088260 og #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), og Batchelor Foundation for pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 og BALB/c mus som brukes i denne studien ble enten avlet i vårt anlegg eller levert av Jackson Labs eller Taconic.
60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
10mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
15mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
18- gauge Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
40 micrometer pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
EDTA, 0.5M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |