Summary
여기서, 우리는 4개의 골수성 혈통에 제대혈 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 면역표현특성 및 사이토카인 유도분화를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 적용은 CD34+ 세포의 골수성 분화에 대한 골수성 질환 돌연변이 또는 소분자의 영향에 대한 조사를 포함한다.
Abstract
인간 조혈줄기세포의 생체내 분화는 조혈을 연구하기 위한 널리 사용되는 모델이다. 여기서 기재된 프로토콜은 4개의 골수성 혈통 세포로 의 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 분화를 유도하는 사이토카인을 위한 것이다. CD34+ 세포는 인간 탯줄 혈액으로부터 단리되고 사이토카인이 존재할 때 MS-5 기질 세포와 병용배한다. 줄기 및 전구 세포의 면역표현특성, 및 분화된 골수성 혈통 세포가 기재되어 있다. 이 프로토콜을 사용하여, CD34+ 세포는 작은 분자로 배양되거나 골수성 분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 골수성 질환 돌연변이를 발현하기 위해 렌티바이러스로 트랜스화될 수 있다.
Introduction
조혈 줄기 세포 (HSCs)의 정상적인 분화는 모든 혈액 세포 계의 생리적 수준의 유지에 중요합니다. 분화 도중, 성장 인자 및 사이토카인을 포함하여 세포외 단서에 조정된 반응에서, HSCs는 먼저 림프-골수성 전위가 있는다능한 전구 (MPP) 세포를 초래합니다 1,2,3 ,4 (그림 1). MPP는 일반적인 골수성 전구 (CMP) 및 일반적인 림프종 전구 (Clps)를 계보 제한되는 초래합니다. CLPs는 B, T 및 자연 킬러 세포로 구성된 림프계로 분화합니다. CmP는 2개의 더 제한된 전구 인구, 거핵구 적혈구 전구체 (MEPs) 및 과립 구체 질 전구체 (GPS)를 통해 골수성 계보를 생성합니다. MEP는 거핵구와 적혈구를 초래하는 반면, GPS는 과립구및 단핵구를 초래합니다. CmPs를 통해 발생하는 것 외에도, 거핵구는 또한 비 표준 경로5,6을통해 HSC 또는 초기 MPP에서 직접 발생하는 것으로 보고되었다.
조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)는 표면 마커 CD34 및 계보 특이적 마커의 결여(Lin-)를 특징으로 한다. HSC 및 골수성 전구 집단을 구별하기 위해 일반적으로 사용되는 다른 표면 마커는 CD38, CD45RA 및 CD123 2(도1)를포함한다. HSC와 MpP는 각각 린-/CD34+/ CD38- 및 린-/ CD34+/ CD38+입니다. 골수성 전구 인구는 CD45RA 및 CD123의 존재 또는 부재에 의해 구별됩니다. CMP는 린-/CD34+/CD45RA-/ CD123lo,GMP는 린-/CD34+/ CD38+/ CD45RA+/CD123로,그리고 MEP는 린-/CD34+ /CD38+/CD45RA-/CD123-.
CD34+ 줄기 및 전구 세포의 총 집단은 인간 탯줄 혈액(UCB), 골수 및 말초 혈액으로부터 얻을 수 있다. CD34+ 세포는 인간 UCB에서 총 단핵 세포 (MNCs)의 0.02 % ~ 1.46 %를 구성하는 반면, 그 비율은 골수에서 0.5 %와 5.3 % 사이에서 변화하며 말초 혈액7,8,9에서 0.01 %로 훨씬 낮습니다. . UCB 유래 CD34+ 세포의 증식 능력 및 분화 전위는 골수 또는 말초 혈액 세포1,10보다현저히 높으며, 이를 통해 구득을 위한 뚜렷한 이점을 제공한다. 분화 하는 동안 세포의 면역 표현 형 및 형태 학적 특성 분석을 수행과 함께 분자 분석을위한 충분한 물질.
제대혈 유래 CD34+ HSPC의 생체내 분화는 정상적인 조혈 및 조혈 질환 기전을 조사하기 위한 널리 적용되는 모델이다. 적절한 사이토카인으로 배양할 때, UCB CD34+ HSPC는 골수성 또는 림프성 혈통11,12,13,14,15를 따라 분화하도록 유도될 수 있다. , 16. 여기서, 우리는 인간 UCB로부터CD34+ HSPC의 격리 및 면역 표현형 특성화및 골수성 혈통 세포에 대한 이들의 분화를 위한 프로토콜을 기술한다. 이러한 배양 시스템은 골수에서 미세환경을 모방하기 위해 MS-5 기질 세포의 존재에 있는 HSPC의 사이토카인 유도 분화에 기초한다. 배양 조건은 CD34+ 세포의 초기 팽창을 일으키고, 이어서 4개의 골수성 계보 세포, 즉 과립구(CD66b), 단핵구(CD14), 거핵구(CD41) 및 적혈구 (CD235a). CD34+ 세포 분화 프로토콜의 응용은 조혈을 조절하는 분자 메커니즘에 대한 연구, 및 골수성 질환 관련 돌연변이 및 소분자가 자가 재생에 미치는 영향에 대한 연구를 포함하고 있으며, HSPC의 차별화.
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Protocol
실험을 위한 인간 탯줄 혈액은 마리코파 통합 건강 시스템 (MIHS), 피닉스에 통보된 동의 후에 건강한 개별에 의해 기증되었습니다. 식별되지 는 단위는 MIHS와 애리조나 대학 사이의 재료 이전 계약을 통해 얻은.
1. 시약 및 버퍼
참고: 생물학적 안전 캐비닛에 멸균 조건하에서 모든 시약과 완충장치를 준비합니다.
- 멸균 PBS-BSA-EDTA (PBE) 완충액을 7.2 mL의 멸균 35% 소 혈청 알부민 (BSA; 사용 멸균 조직 배양 등급 35% BSA) 및 멸균 0.5 M 에틸렌 당탄 테트라 아세트산 (EDTA)의 5 mL를 487.8 mL에 첨가하여 제조 식염수 (DPBS). 필터 살균 및 탈가스 버퍼는 적어도 2 시간 동안 생물학적 안전 캐비닛에 진공에 부착 된 필터를 방치하여 더 작은 부피 (250 mL)에서 탈 가스 완충액을 4 °C에서 저장합니다.
- 행크스 균형 소금 용액 1회(HBSS 1x)를 준비합니다. 멸균 증류수 900mL에 10x HBSS 스톡 100mL을 희석하여 1X HBSS 의 1L을 만들고 pH를 7.2로 조정합니다. 사용하기 전에 1x HBSS를 살균하는 필터.
- 증류수 98 mL에 2 mL의 빙하 아세트산을 추가하여 2 % 아세트산 용액을 준비하십시오.
- 1x PBS에서 20 ng/mL 재조합 인간 피브로넥틴 단편 용액을 준비합니다. 48 웰 플레이트 당 10 mL을 만드십시오.
- 준비 2% BSA. 100 mL 1x PBS에 BSA 분획 V. 필터를 사용하기 전에 2 그램을 추가하십시오.
- DMEM 분말, 중탄산나트륨 3.7gm, 태아 소 혈청(FBS) 및 5 mL 페니실린-스트렙토마이신(PS)을 멸균 증류수 800mL에 첨가하여 DMECco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)를 완성하십시오. 부피를 1L까지 혼합하고 구성하고 사용하기 전에 필터멸균을 합니다.
- 90 mL의 FBS와 멸균 디메틸 설폭사이드 (DMSO)의 10 mL를 혼합하여 동결 매체를 준비합니다.
- 자극 매체를 준비합니다. 혈청 프리 배지에 L-글루타민을 2 mM에 추가하고 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), FMs 와 같은 티로신 키나아제 3 리간드 (Flt3L) 및 인터류킨-3 (IL3)에 대한 20 ng / mL의 최종 농도에 시토카인을 추가하십시오.(Il3 참조) 사이토 카인 스톡 솔루션의 준비). 48 웰 플레이트 당 5 mL을 만드십시오.
- 골수성 분화 배지1회 준비. DMEM을 완료하려면 SCF, Flt3L 및 IL3의 경우 5 ng/mL, TPO의 경우 50ng/mL, 에리스로포이에틴(EPO)의 경우 4단위/mL의 최종 농도에 사이토카인을 추가합니다. 48 웰 플레이트 당 5 mL을 만드십시오.
- 골수성 분화 배지를 2배 준비합니다. DMEM을 완료하려면 SCF, Flt3L 및 IL3의 경우 최종 농도 10 ng/mL, TPO의 경우 100ng/mL, EPO의 경우 8단위/mL에 사이토카인을 추가합니다. 48 웰 플레이트 당 5 mL을 만드십시오.
- 유세포 분석 버퍼를 준비합니다. 1x PBS의 1 L에, BSA 분획 V의 10 g을 추가합니다.
- 1x PBS에서 1% 파라포름 알데히드를 준비합니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
- 1x PBS의 49.5 mL에 10 mg/mL 폴리-L-리신의 500 μL을 추가하여 폴리-L-리신 용액을 준비합니다.
2. 배꼽 코드 혈액에서 단핵 세포의 격리
참고: 아래에 기술된 프로토콜의 경우, 90~100 mL의 코드 혈액 부피가 사용되었다. CD34+ 세포의 분리는 생물학적 안전 캐비닛의 멸균 조건하에서 수행되어야 합니다.
- UCB가 함유된 가방에 70% 에탄올을 뿌려 외부 표면을 살균한 후 생물학적 안전 캐비닛에 넣습니다. UCB를 멸균 된 250 mL 플라스틱 병에 옮기고 동일한 부피 (RT) 1x HBSS를 추가하여 1 : 1을 희석하십시오.
- 튜브당 MNC 분획 배지 15 mL(MFM; 재료 표참조)을 약 6개의 멸균 50 mL 원엽 튜브에 분배합니다. MFM으로 튜브를 기울이고 희석 된 UCB 30mL를 MFM 층에 부드럽게 부어 방해하지 않습니다.
- 느린 가속과 브레이크없이 RT에서 30 분 동안 400 x g의 튜브를 원심 분리합니다.
- 원심 분리 후, MNC 층 위의 플라즈마의 15-20 mL 사이에서 흡인한다. 피펫으로 MPC를 부드럽게 수집하고 새로운 50mL 원엽 튜브로 옮김을 제공합니다.
참고: MNC는 혈장 및 MFM의 계면에서 백색 버피 층으로서, 및 원엽 관의 바닥에 적혈구(RBC) 퇴적물을 침전한다. - 풀 MNC는 함께 2-3 튜브에서 수집. 차가운 PBE 버퍼로 각 튜브의 부피를 50 mL까지 구성합니다.
- 4 °C에서 10 분 동안 300 x g의 튜브를 원심 분리하고 브레이크를 낮게 합니다.
- 상급제 흡입하고 튜브를 부드럽게 눌러 세포 펠릿을 느슨하게합니다.
- 얼음 차가운 PBE 완충제의 5 mL에서 펠릿 세포를 다시 중단시다. 동일한 5 mL의 재부유 세포를 사용하여 다른 튜브에서 세포를 수집합니다. 하나의 50 mL 원뿔 튜브에 함께 3 ~ 4 개의 튜브에서 세포를 결합합니다.
- 남은 세포를 수집하려면 5 mL의 차가운 PBE 버퍼로 모든 튜브를 세척하고 50 mL 원추형 튜브에 추가하십시오.
- 세포 현탁액 10 μL을 490 μL 아세트산 용액으로 희석하여 MBC를 계산합니다.
참고: 아세트산은 MBC의 쉬운 계산을 허용하기 위해 오염 된 RBC를 용해. - 얼음 차가운 PBE 버퍼로 셀 서스펜션의 부피를 50 mL로 구성합니다. 4 °C에서 10 분 동안 300 x g에서 세포를 원심 분리하고 브레이크를 낮게 합니다.
참고: MNC 서스펜션은 CD34+ 셀의 격리를 위해 즉시 처리되거나 이후 의 적용을 위해 동결될 수 있다. - MBC를 동결하려면 상급체를 제거하고 RT에서 동결 매체에서 2 x 107 셀 / mL의 밀도로 다시 일시 중단하십시오.
- 세포를 밤새 -80°C에서 동결된 후 액체 질소로 옮김을 넣습니다.
3. 단핵 세포에서 CD34+ 세포의 분리
- 새로 고립된 MMC를 사용하는 경우 3.3단계로 직접 진행한다.
- 동결 된 MTO를 사용하는 경우, 37 °C 수조에서 냉동 세포를 신속하게 해동하고 50 mL 원엽 튜브로 옮김을 옮김. 얼음 차가운 PBE 버퍼 1 mL로 바이알에 남아있는 세포를 수집하고 50 mL 원추형 튜브로 옮김.
- MNC 현탁액의 부피를 50 mL까지 차가운 PBE 버퍼와 원심분리기를 600 x g에서 4°C에서 5분 동안 구성합니다.
- 상급체를 제거하고 튜브를 부드럽게 눌러 셀 펠릿을 느슨하게합니다. MTO를 300 μL의 얼음 차가운 PBE 버퍼에서 1 x 108 셀로 다시 일시 중단합니다.
- 자기 활성화 세포 선별(MACS) 인간 CD34 마이크로비드 키트에서 100 μL의 FcR 차단 시약을 1 x 108 MNC당 넣고 부드럽게 섞습니다.
참고: 이는 CD34 마이크로비드에 대한 비특이적 결합을 차단한다. - 1 x 108 셀 당 CD34 마이크로 비드 의 100 μL을 추가합니다. 부드럽게 섞고 냉장고에서 30분 동안 4°C에서 배양합니다. 얼음에 배양하지 마십시오.
- 세포가 인큐베이션되는 동안, MACS 분리기 자기장에 LS 컬럼 과 사전 분리 필터를 놓습니다. 사전 분리 필터에 2 mL과 1 mL를 직접 컬럼에 추가하여 얼음 차가운 PBE 버퍼로 컬럼을 평형화합니다. 컬럼이 15mL 원추형 튜브로 비우고 흐름을 취소합니다.
- MPC를 4°C에서 제거하고, 얼음-차가운 PBE 버퍼를 추가하여 부피를 15 mL로 구성하고, 4°C에서 10분 동안 300 x g의 세포를 원심분리하고, 브레이크를 낮게 유지합니다.
- 상월체를 흡인하고 얼음 차가운 PBE 완충제의 1 mL에서 세포를 다시 중단시딩한다.
- LS 컬럼에 배치된 사전 분리 필터에 셀 서스펜션을 추가합니다.
참고: 사전 분리 필터는 열을 차단할 수 있는 큰 셀 집계를 제거합니다. - 3 mL의 얼음 차가운 PBE 버퍼로 튜브를 헹구고 LS 컬럼에 놓인 사전 분리 필터에 추가하십시오. 그 후 사전 분리 필터를 폐기합니다.
- 3 mL의 얼음 차가운 PBE 버퍼를 추가하여 LS 열을 4 번 씻어 매번 열이 배출 될 수 있도록합니다.
참고: CD34+ 셀은 열에 바인딩된 상태로 유지되며 레이블이 지정되지 않은 셀은 컬럼을 통해 흐르게 됩니다. - 최종 세척 후 MACS 분리기 자기장에서 컬럼을 제거하고 자석에서 떨어진 새로운 15mL 원엽 튜브에 놓습니다.
- 컬럼에 5 mL 얼음 차가운 PBE 버퍼를 추가하고 플런저를 단단히 밀어 바인딩 된 CD34+ 셀을 추방하십시오.
- 선택적으로, 전술한 바와 같이 사전 분리 필터를 가진 다른 LS 컬럼에 제1 컬럼으로부터 분리된 CD34+ 셀을 통과한다(단계 3.10−3.13).
- 리시반 블루(10 μL의 셀및 10 μL의 트리판 블루)로 단리된 CD34+ 세포를 계산하여 총 살아있는 세포 수를 결정한다.
참고: 이 단계에서, 단리된 CD34+ 세포는 나중에 사용하기 위해 동결되거나 유세포 분석(섹션 4)에 의한 HSPC의 분석을 위해 직접 처리될 수 있거나 또는 골수성 계보 세포(섹션 5)로의 분화를 위해 서있다. - RT에서 5분 동안 600 x g의 셀 서스펜션을 원심분리하고 브레이크를 낮게 합니다.
- CD34+ 세포를 동결시키기 위해, 상피체를 흡인하고 상술한 바와 같이 동결 배지의 1 mL에서 최대 5 x 106 세포를 다시 현탁시키고 동결한다(단계 2.13). 그렇지 않으면 섹션 4 또는 5로 진행합니다.
4. 유세포측정에 의한 줄기 및 선조 집단의 결정
- 갓 단리된 CD34+ HSPC에서 줄기 및 전구 집단의 분획을 결정하기 위해, 원심분리기 600 x g에서 5분 동안 원심분리하고 50 μL의 유세포분석 버퍼에서 1 x 106 세포를 다시 중단한다.
- 1 x 106 CD34+ 셀에, 계보 마커 (CD3, CD7, CD10, CD10, CD11b, CD19 및 CD235a ) 에 항체를 추가하십시오 - 모든 FITC 라벨), CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD45RA (PE-Cy7), CD45RA (PE-Cy7), CD123 (7PC) 아미노액티노마이신 D (7-AAD; 살아있는/죽은 얼룩)를 구성하고 총 부피를 100 μL로 구성합니다.
참고: 1 x 106 CD34+ 셀 미만이 분석을 위해 사용될 수 있다. 더 적은 세포를 염색하는 경우에, 추가된 항체의 총 부피 및 부피는 그에 따라 감소되어야 합니다. 유세포 분석의 경우, 얼룩이 없고 염색된 MNC를 각 형광소에 대해 양수 및 음수 게이트를 설정하기 위한 컨트롤로 사용해야 합니다. - 배양 후, 1 mL의 유세포 분석 버퍼로 세포를 씻고 원심 분리기를 600 x g에서 5 분 동안 씻으십시오.
- 선택적으로, RT에서 어둠 속에서 10 분 동안 1 % 파라 포름 알데히드 용액의 0.5 mL에 염색 된 세포를 고정시다.
- 600 x g에서 5 분 동안 원심 분리기를 하고 상월체를 흡인합니다.
- 1 mL의 유세포 분석 버퍼로 고정/염색된 세포를 세척하고 원심분리기를 600 x g에서 4°C에서 5분 동안 세척합니다.
- 상월체를 흡인하고, 500 μL의 유세포분석 버퍼에서 세포를 다시 현탁시키고, 유동세포계계(물자 표)로 분석한다.
5. CD34+ 조혈 줄기 및 전조 세포의 골수성 분화
참고: CD34+ HSPC를 골수성 계보 세포와 분화하기 위해, 이들은 먼저 재조합 인간 섬유넥틴 단편 코팅 플레이트에서 자극한 다음 골수성 분화 배지에서 MS-5 기질 세포의 층에 시드한다. 분화는 4개의 골수성 혈통에 특이적인 세포 표면 마커의 발현에 기초하여 3주 동안 매주 모니터링될 수 있다. 자극 및 분화 동안, 모든 배양은 가습 챔버에서 37°C 및 5% CO2에서 수행된다. 모든 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행해야합니다.
- RT에서 2 시간 동안 1x PBS에 재조합 인간 섬유넥틴 용액200 μL / well을 추가하여 멸균되지 않은 48 웰 플레이트의 우물을 코팅하십시오.
- 2 시간 후, 조심스럽게 재조합 인간 섬유넥틴 용액을 제거하고 폐기하십시오.
- RT에서 30 분 동안 200 μL / 2 % BSA의 우물을 차단하십시오.
- BSA 용액을 흡인하고 멸균 1x PBS 의 500 μL로 우물을 두 번 세척하십시오.
참고: 피브로넥틴 단편 코팅 플레이트는 최대 2주 동안 4°C에서 보관될 수 있다. - CD34+ HSPC를 자극하려면, 1 x 105 세포/200 μL 또는 따뜻한 1x 자극 배지의 5 x 105 세포/mL의 밀도로 새로 단리된 세포(3.17단계로부터)를 다시 일시 중단합니다.
- 동결된 CD34+ 세포를 사용하는 경우, 세포를 빠르게 해동하고 따뜻한 완전한 DMEM을 함유하는 15 mL 원엽 관으로 옮김. 600 x g에서 5분 동안 원심분리기를 하고 5.5단계에서 설명한 바와 같이 세포를 다시 현탁시한다.
- 플레이트 200 μL의 CD34+ 섬유넥틴 단편당 세포 현탁액을 코팅된 48-웰 플레이트 및 48시간 동안 배양한다.
- 다음날, 종자 15,000 MS-5 기질 세포에서 200 μL의 완전한 DMEM의 웰당 48웰 조직 배양 처리 플레이트및 37°C에서 24시간 동안 배양하였다.
- 48 시간 의 자극 후, 부드러운 파이펫팅에 의해 CD34+ 세포를 수집합니다. 500 μL의 따뜻한 DMEM으로 우물을 씻고 셀 서스펜션으로 풀을 씻으하십시오.
- 트라이판 블루로 셀을 계산합니다. 600 x g에서 5분 동안 현탁액을 원심분리하고 1x 골수성 분화 배지의 5,000 세포/200 μL의 밀도에서 다시 현탁한다.
- 48웰 조직 배양 플레이트에서 MS-5 기질 세포로 시드하고, 세포를 방해하지 않고 배지를 부드럽게 흡인한다. 플레이트의 웰당 CD34+ 세포 현탁액의 200 μL(5,000 셀)을 층으로 하고 37°C에서 배양한다.
참고: MS-5 세포의 배양은 완전한 DMEM에서 유지될 수 있다. CD34+ 세포가 시드되는 날, MS-5 세포는 균일 한 층 (80-90 % 합류)에 있어야합니다. MS-5 세포는 CD34+ 세포의 시딩 전에 적어도 24시간 전에 도금되는 것이 좋습니다. MS-5 세포가 CD34+ 세포를 시종하기 전에 48시간 또는 72시간 도금되어야 하는 경우, 세포 밀도는 그에 따라 조정되어야 한다. 또한 48웰 플레이트의 주변 우물을 비워 두거나 가장자리 효과를 피하기 위해 200 μL의 멸균수로 채워두는 것이 좋습니다. - 각 웰의 상부에서 배지의 100 μL을 부드럽게 제거하고 웰당 2x myeloid 분화 배지의 100 μL로 대체하여 3-4일마다 반중간 변화를 수행합니다.
- 21일째에, 유세포분석에 의한 골수성 계보 마커 발현 분석을 위해 세포를 수확한다. MS-5 층을 방해하지 않고 매체를 부드럽게 피펫하고 세포를 5 mL 튜브로 옮김하십시오.
참고: 염색 및 유세포 분석의 경우, 1-2웰의 세포는 충분합니다. 분화는 또한 1일, 7일 및 14일에 모니터링될 수 있다. 여러 날에 면역 세포증을 수행하는 경우 분석에 필요한 우물의 수를 그에 따라 계산해야합니다. - CD34(APC-Cy7), CD66b(PE-Cy7), CD14(PE), CD41(PerCP-Cy5.5) 및 CD235a(APC)에 대한 항체가 있는 5 x 105개의 세포를 총 부피 50μL의 총 부피에서 20분 동안 얼음 위에 인큐베이트합니다. 각 형광에 대한 긍정적 이고 부정적인 게이트, 및 분석에서 죽은 세포를 제거하기 위해 살아있는 / 죽은 얼룩으로 7-AAD.
- 전술한 바와 같이 염색된 세포를 세척하고 고치면(선택사항)한다(단계 4.3-4.6).
- 유세포분석 버퍼의 500 μL에서 세포를 다시 중단하고 유세포계에 의해 분석한다.
6. 세포 형태학의 평가
- 에탄올을 분사하고 삐걱 거리는 때까지 닦아 현미경 슬라이드를 청소합니다.
- 깨끗한 슬라이드를 RT에서 5분 동안 폴리-L-리신 용액에 담그고 RT에서 1시간 동안 건조시면 됩니다.
- 3.14단계에서 HSPC를 재중단시키고 10 μL의 유세포분석 버퍼에서 5.13단계로부터 분화된 세포를 재중단한다.
- 셀 서스펜션을 코팅된 슬라이드로 옮기고 공기 건조 상태로 둡니다.
참고: 1일째부터 21일째까지의 슬라이드는 RT에 보관하고 동시에 염색할 수 있습니다. - 슬라이드에 라이트-지엠사 얼룩 0.5 mL를 붓고 RT에서 3 분 동안 방치하십시오.
- 동일한 양의 이온수를 추가하고 RT에서 10분 더 방치하십시오.
- 슬라이드를 탈이온수로 씻습니다.
- 현미경으로 60x 또는 100x배의 배율로 염색된 세포를 시각화합니다.
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Representative Results
상기 프로토콜의 적용은 ~100 mL의 제대혈 단위로부터 5.6(±0.5) x 108 MNC 및 1(±0.3) x 106 CD34+ 세포를 산출한다. 총 CD34+ 셀의 백분율은 80-90 % 사이의 범위입니다 (그림2A,B). Manz et al.5에 의해 기술된 계획에 의한 면역 표현형 분석은 CD34+ 세포가 일반적으로 린-/CD34+/CD38-및 린 -/CD34+인 ~20% HSC 및 ~72% MPP로 구성된다는 것을 보여줍니다. /CD38+, 각각 (그림1 및 그림 2A). MPP 인구에서, CMP의 백분율 (린-/ CD34+/ CD38+/ CD123로/ CD45RA- ),GMP (린-/ CD34+/ CD38+/ CD123로/ CD45RA+), 및 MEP(Lin-/CD34+/CD38+/CD123-/CD45RA-)는 각각 약 25%, 15%, 및 56%이다(도1 및 도 2B).
골수성 분화 조건에서 단리된 HSPC의 배양 동안, CD34 마커의 점진적 손실이 있다. 면역페노티핑은 CD34+ 세포의 백분율이 격리시 ~90%에서21일째 ~23%로 감소한다는 것을 보여준다(도3B). CD34의 분석은- 집단은 성숙한 골수성 계보 마커를 발현하는 세포의 백분율에 수반되는 상승을 보여준다. 단핵구에 대한 마커를 발현하는 세포의 비율이 1.7%에서 12%로, 과립구(CD34-/CD14-/CD66b+)의경우 1.3%에서 5.3%로 증가합니다. 거핵구 (CD34-/ CD41+/ CD235a-) 1.8 % ~ 8 %, 적혈구 세포 (CD34-/ CD41-/ CD235a+) 0.7 % ~ 11 % (그림3C). 라이트-Giemsa 염색 된 세포의 검사는 1 일째와 21 일째에 세포의 형태학적 특성이 구별된다는 것을 보여줍니다. 미분화 세포에는 큰 둥근 핵이 있고, 아주 작은 세포질이 있습니다. 한편, 분화된 배양으로부터의 세포는 성숙한 단핵구, 과립구 및 적혈구를 포함하는 계보 세포의 특성을 나타낸다(도 4). 따라서, 본 프로토콜에 기재된 배양 조건은 골수성 계보 세포로 UCB CD34+ 세포의 분화를 촉진한다.
그림 1 : 조혈 차별화 도식. 다능성 조혈 줄기 세포 (HSC)는 일반적인 골수성 전구 (CMP) 및 일반적인 림프종 전구 (CLP) 세포를 초래하는 다능한 전구체 (MPP)로 분화합니다. CmPs는 2개의 다른 골수성 전구, 과립구 단핵구 전구체(GPS) 및 거핵구 적혈구 전구체(MEPs)를 생성합니다. 과립구와 단핵구는 GMP에서 발생하고, 적혈구와 거핵구는 MEPs에서 생겨나기. CLPs는 자연 살인자, B 및 T 세포를 초래합니다. 이 프로토콜에서 세포 집단을 특성화하는 데 사용되는 세포 표면 마커가 표시된다. 이 그림은 Bapat 외11에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 조혈줄기와 전구세포의 면역세포 분석. (a) 세포는 단일 세포 집단을 선택하기 위해 전방 및 측면 산란에 게이트되었다. 죽은 세포와 계보 양성 세포는 CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 및 CD235a(모든 FITC 염색)에 7-AAD 및 항체로 염색함으로써 제거되었다. 린-/라이브 세포는 CD34(APC-Cy7), CD38(PE), CD123(APC) 및 CD45RA(PE-Cy7)에 대한 항체로 분석하였다. 전구는 CD34+ /CD38+ 세포로부터 구별되었다. CMP는 CD123 lo/CD45RA-,GMP는 CD123 lo/CD45RA+ 및 MEP는 CD123- /CD45RA-. 실험의 대표적인 분산형 플롯이 표시됩니다. (B) 총 HSPC(총 CD34+ 세포), CMP, GMP 및 제대혈의 MEP의 백분율이 나타난다. 제시된 데이터는 적어도 3개의 독립적인 실험에서 표준 오차가 있는 평균입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 골수성 혈통 세포의 면역 세포 분석. 단일 셀은 전진 및 측 산란에 기초하여 게이트되었다. CD34-세포는 CD34(APC-Cy7)에 대한 항체로 염색함으로써 선택되었다. CD34에서의 골수성 혈통-집단은 CD14(PE), CD66b(PE-Cy7), CD41(PerCP-Cy5.5), 및 CD235a(APC)에 대한 항체로 분석되었다(A)및 21일째(B). 단핵구는 CD14+/ CD66b-과립구는 CD14-/ CD66b+, 거핵구는 CD41+ /CD235a- 및 적혈구는 CD41-/CD235a +이다. 실험의 대표적인 분산형 플롯이 표시됩니다. CD34에서 단핵구, 과립구, 거핵구 및 적혈구 세포의 분획-1일째 및 21일째에 집단이 표현된다(C). 제시된 데이터는 적어도 3개의 독립적인 실험에서 표준 오차가 있는 평균입니다. 이 그림은 Bapat 외11에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : HSPC와 분화 세포의 대표적인 이미지. CD34+ HSPC(A) 및 21일째골수체 배양으로부터의 세포는 라이트-Giemsa 얼룩으로 염색하였다. 과립구 (검은 화살표), 단핵구 (파란색 화살표) 및 적혈구 세포 (적색 화살표)에 해당하는 세포가 표시됩니다. 축척 막대는 10mm를 나타냅니다. 이 그림은 Bapat 외11에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 기재된 프로토콜은 UCB 유래 CD34+ HSPC의 생체 내 분화에 적합하여 4개의 골수성 혈통으로 한다. SCF, TPO, Flt3L 및 IL3로 구성된 사이토카인 혼합물을 사용하여 초기 배양은 CD34+ 세포를 자극한다. 그 후, SCF, IL3, Flt3L, EPO 및 TPO의 칵테일로 차별화가 달성됩니다. 이 혼합에서, SCF, IL3 및 Flt3L은 CD34+ HSC의 생존과 확산에 중요합니다. EPO와 TPO는 각각 적혈구 및 거핵구로 의 분화를 촉진하고 IL3는 초기 과립구 단핵구의 분화를 촉진합니다. 전구체 및 성숙한 세포13,17,18. 이 방법에 대한 한 가지 주의사항은 분화 된 세포의 백분율에서 관찰 된 변화입니다. 이것은 계보 세포를 초래하기 위하여 다른 공여자에게서 격리된 CD34+ HSPC의 수용량에 있는 다름 때문일 수 있었습니다.
MS-5 세포의 층은 CD34+ HSPC의 효율적인 분화를 위해 중요하다. 우리의 경험에서, MS-5 세포는 CD34+ 세포의 시딩 하기 전에 적어도 24 시간 도금 될 필요가 있다. 80-90 %에서 MS-5 세포의 합류를 유지하는 것이 중요합니다. 과잉 결합MS-5 세포는 분리하는 경향이 있고, 더 낮은 conconi성은 감소된 분화를 일으키는 원인이 됩니다. 배양 도중, CD34+ 세포는 ~50 배 확장합니다. 그(것)들은 14 일까지 수렴되고 수확되고 새로운 접시에 MS-5 세포를 포함하는 추가 우물로 분할될 필요가 있습니다.
매체 변화의 빈도는 또한 효율적인 분화를 위해 중요하며 최적의 사이토카인 농도를 유지하기 위해 3-4일마다 수행되어야 합니다. 적은 매체 변경 및 더 낮은 사이토카인 농도, 둘 다 CD34+ HSPC의 증식 및 분화의 감소를 야기한다. 다량의 사이토카인에 대한 이러한 요구 사항은 비용을 크게 증가시킬 수 있으므로 이 프로토콜의 한계입니다. 대규모 실험에 대한 또 다른 제한은 코드 혈액의 단위로부터 얻은 CD34+ 세포의 수입니다. 전형적으로, ~100 mL의 신선한 UCB 단위는 약 백만 개의 CD34+ 셀을 산출한다. 24시간을 초과하는 유닛을 보관하면 수율이 현저히 줄어듭니다. CD34+ 세포의 순도의 추가 손실은 표지되지 않은 오염 세포를 제거하는 데 중요한 컬럼 세척 단계 동안 발생할 수 있다. 세척 단계 동안 열이 막히면 막힌 열의 바인딩된 셀을 용출하고 새 열에 다시 로드하여 CD34+ 셀의 순수 한 모집단을 얻는 것이 좋습니다.
문헌에서, 다른 사이토카인 조합은 거핵구, 적혈구, 또는 과립 단핵구 혈통19,20,21,22로 분화를 촉진한다고 보고되었다. . 이 프로토콜의 장점은 단핵구, 과립구, 거핵구 및 적혈구와 같은 네 가지 골수성 집단을 따라 분화를 허용한다는 것입니다. 따라서, 정상적인 골수성 분화를 연구하고 골수성 질환(골수이형성 증후군, 급성 골수성 백혈병, 골수증식성 신생물 및 기타)의 영향을 조사하기 위해 사용될 수 있다. CD34+ 세포11,12,23,24,25의증식 및 분화 동안 분자 및 세포 표현형에 대한 염색체 전좌. 이 프로토콜은 또한 항-염증성 사이토카인의 영향을 조사하고, 골수성 분화에 대한 잠재적 치료 약물의26,27,28의영향을 조사하기 위해 사용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 비식별 및 기증 코드 혈액 단위에 대한 마리코파 통합 건강 시스템의 웬디 배럿, 레이첼 카바예로, 가브리엘라 루이스, 흐름 세포 측정에 대한 도움을 Mrinalini 칼라, 게이 도둑과 크리스토퍼 씨트에 감사드립니다 전 생체 골수성 분화에 대한 조언. 이 작품은 건강의 국가 학회 (R21CA170786 및 R01GM127464)와 미국 암 학회 (기관 연구 보조금 74-001-34-IRG)에서 S.S.에 기금에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2,000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
References
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