케노하브디티스 예쁜꼬마선충에서 2-아라키도노일글리세롤의 정량화를 위한 신분화 표준의 합성
Summary
이 작품은 C. elegans에있는 endocannabinoid 2-아라키도노이드 글리세롤 (2-AG)를 검출하고 정량화하는 강력하고 간단한 방법을 기술합니다. 분석 적 증명 기준은 동위원소 희석 및 액체 크로마토그래피-전기 분무 이온화-탠덤 질량 분석법(LC-ESI-MS/MS)에 의한 2-AG의 정량화에 제조및 사용되었습니다.
Abstract
이 작품은 액체 크로마토그래피-전기 분무 이온화-탠덤 질량 분광법(LC-ESI-MS/MS)에 의해 2-아라키도노일 글리세롤(2-AG)을 질적 및 정량적으로 분석하기 위한 분석 표준을 준비하는 방법을 제시한다. 엔도 칸 나비 노이드는 다양한 유기체에서 여러 생물학적 과정을 조절하는 보존 지질 중재자입니다. C. elegans에서,2-AG는 다이어 형성과 콜레스테롤 대사의 변조를 포함하여 다른 역할을 가지고 있는 것으로 밝혀졌습니다. 이 보고서는 2-AG 정량화에 필요한 중형 표준의 비용 및 안정성과 관련된 어려움을 극복하는 방법을 설명합니다. 표준의 합성 절차는 간단하며 유기 합성 전문 지식이나 특수 장비없이 모든 실험실에서 수행 할 수 있습니다. 또한, C. elegans 배양으로부터 증명된 표준을 추출하는 Folch의 방법의 변형이 설명된다. 마지막으로, 안정된 동위원소 표지된 아날로그 1-AG-d5를 사용하여 2-AG를 검출하는 정량적 및 분석적 방법이 설명되어, 이는 빠른 크로마토그래피 실행에서 신뢰할 수 있는 결과를 제공한다. 절차는 또한 다른 유기체에 있는 대사 산물의 그밖 연구 결과에 적용되는 동안 C. elegans에 있는 2-AG의 다중 역할을 공부하기 를 위해 유용합니다.
Introduction
엔도 칸 나비 노이드는 다양한 유기체에서 여러 생물학적 과정을 조절하고 지질 중재자1. 첫 번째로 발견되고 가장 잘 특징지어지는 엔도칸나비노이드는 아난다미드(아라키도노일레탄올라미드, AEA) 및 2-아라키도노일 글리세롤(2-AG)입니다. 엔도 칸 나비 노이드는 많은 중요한 역할을, 뇌 보상 시스템뿐만 아니라 약물 중독에 관련된 사람들을 포함, 메모리, 기분, 및 대사 과정2. AEA 및 2-AG는 필요할 때만 합성되고 수명이 짧으며 운반 단백질 재섭취 및 가수 분해3을통해 분해됩니다.
예쁜꼬마선충(C.elegans)과같은 동물 모델의 사용은 세포사멸, 세포 신호, 세포 주기, 세포 극성, 유전자 조절, 대사, 노화, 및 섹스 결정4,5. 또한, C. 예쁜꼬마선충은 고도 불포화 지방산 (PUFAs)의 생리적 역할을 연구하기위한 훌륭한 모델입니다. AEA는 C. 예쁜꼬마선충에서 확인되었으며 식이제한6에 따라 감소됩니다. 이 결핍은 엔도 칸 나비 노이드와 보충에 의해 억제 될 수있는 식이 제한 메커니즘을 통해 선충의 수명을 연장. 최근에는 2-AG와 AEA가 C. elegans7에서콜레스테롤 인신 매매의 조절에 근본적인 역할을한다는 것이 밝혀졌습니다. 더 중요 한 것은, 외 인 2-AG와 보충 다 이어 체포를 구출할 수 있습니다 결정 했다, 니만-픽 유형 C1 C. elegans 돌연변이에서 장애인된 콜레스테롤 인신 매매에 의해 발생 하는.
선충에서 콜레스테롤 인신 매매 및 기타 생물학적 과정 (즉, monoaminergic 신호, 항혈및 운동)과 2-AG의 관계를 더 잘 이해하려면이 내인성 대사 산물과 방법을 연구하는 것이 중요합니다. 특정 환경 및 식이 조건하에서영향을 받는8,9,10,11,12,13. 따라서, 다른 분야의 과학자, 특히 이와 관련하여 선충의 행동을 연구하는 사람들에게 사용하기 가 간단한 C. elegans에서 내인성 2-AG를 감지하고 정량화하는 방법을 설계하고 최적화하는 것이 필수적입니다. 엔도 칸 나비 노이드.
2008년, 레톤과 동료들은 LC-MS 분석 방법14를사용하여 C. elegans에서 2-AG 및 AEA를 식별하는 데 성공했습니다. 2011 년, 그들은 다른 엔도 칸 나비 노이드15이기술을 확장 할 수 있었다. 최근 연구는 질량 분석및 GC-MS 16,17, 18,및18을포함하여 C. elegans에있는 endocannabinoids를 검출하고 정량화하는 성공한 그밖 분석 방법을 보여주었습니다 또한 유사한 분석 방법이 다른모델(19)으로확장될 수 있다고 보고되었다.
생물학적 샘플에서 2-AG를 정량화하는 데 사용되는 이전에 보고된 분석 방법은 일반적으로 상업적으로 획득되고 구매20,21에대한 가용성을 요구하는 중증 분석 표준의 사용을 포함한다. 엔도 칸 나비 노이드의 LC-MS / MS 정량화에 대한 많은 분석 표준은 다른 공급자에서 상업적으로 사용할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 그들은 비싸고 민감하며, 여러 이중 결합의 존재로 인해 시간이 지남에 따라 산화됩니다. 이들 표준의 가장 일반적인 버전은 옥타-분해 아라키돈산을 기반으로 하며 동위원소 희석 LC-MS/MS14,22에의한 정량화에 적합하다. 또한, 이러한 표준의 대부분은 글리세롤의 위치 2에서 대체, 그들은 아실 마이그레이션하는 경향이 있기 때문에 대부분의 조건에서 불안정하게19,23.
이러한 deuterated 표준의 비용 및 안정성과 관련된 어려움을 극복하기 위해, 편리하고 간단한 방법은 글리세롤-d5에기초하여 분석 표준을 준비하는 제시된다. 펜타-제형 표준을 준비하는 서열은 안정적이고 아실 이동을 거치지 않는 표준 1-AG-d5를초래하는 3단계 절차가 필요하다(2-모노아실글리세롤을 합성하는 것을 목표로 할 때의 주요 문제).
여기서 주요 목적은 분석 제명 표준의 합성, 선충 시료의 준비 및 추출, LC-MS/MS에 의한 분석(그림 1)을 포함하여 C.elegans에서2-AG를 연구하는 간단하고 재현 가능한 방법을 보여주는 것입니다. ). 이 합성 절차는 정교한 유기 합성 지식 이나 특수 장비 없이 달성 할 수, 엔도 칸 나비 노이드 영향아래 C. 예쁜 꼬마 행동을 공부하는 다른 분야의 과학자에 적합하게. 이 방법은 다른 연구 모델로도 확장할 수 있으므로 다른 대상에 유용합니다. 여기에 보고된 바와 같이, 이 표준은 재현 가능한 방식으로 2-AG를 효과적으로 검출하고 정량화할 수 있는 빠르고 신뢰할 수 있는 크로마토그래피 방법을 성공적으로 개발하기 위해 적용되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
엔도 칸 나비 노이드는 C. elegans7에서dauer 형성의 조절에 연루 된 지질의 클래스입니다. 보다 구체적으로, 고도 불포화 지방산의 합성 (PUFAs) 콜레스테롤 인신 매매와 벌레의 생식 발달에 대 한 중요 한. 엔도칸나비노이드를 함유한 아라키돈산인 2-AG가 콜레스테롤 대사를 방해한 벌레의 정상 주기로 다이어 애벌레를 회복시키는 책임이 있는 것으로 밝혀졌습니다<sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 기관 Nacional 드 프로모시온 Científica y Tecnológica에서 연구 보조금에 의해 지원되었다 (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P., B.H.C.는 CONICET의 펠로우입니다. D.d.M.과 G.R.L.은 CONICET의 연구 경력의 구성원입니다. LC-MS 분석과 유용한 토론을 위해 곤잘로 람베르토(INMET)에 감사드립니다. 비디오 촬영 및 편집은 디레시온 드 코무니카시온 드 라 시엔시아, 파쿨타드 드 시엔시아 폴리티카 y Relaciones Internacionales, Universidadional 데 로사리오, 아르헨티나에서 라미로 오르테가와 마리아 솔레다드 카사솔라에 의해 수행되었습니다.
Materials
| 4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
| antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
| tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
| UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
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