カエノルハブ炎エレガンスにおける2-アラチドノイルグリセロールの定量のための過熱基準の合成
Summary
本研究では、C.エレガンスにおけるエンドカンナビノイド2-アラキドノイルグリセロール(2-AG)を検出し、定量する堅牢でわかりやすい方法について述べている。同位体希釈および液体クロマトグラフィー-エレクトロプレーメントイオン化タンデム質量分析法(LC-ESI-MS/MS)による2-AGの定量に使用した分析的過熱規格です。
Abstract
本研究では、液体クロマトグラフィー・エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法(LC-ESI-MS/MS)により、2-アラキドノールグリセロール(2-AG)を定性的かつ定量的に分析する分析基準を作成する方法を提示する。エンドカンナビノイドは、様々な生物の複数の生物学的プロセスを調節する保存脂質メディエーターです。C.エレガンスでは、2-AGは、ダウアー形成およびコレステロール代謝の変調を含む異なる役割を有することが見出されている。本報告では、2-AG定量に必要な過量規格のコストと安定性に関連する困難を克服する方法について説明する。標準の合成のためのプロシージャは簡単で、有機合成の専門知識または特別な装置の必要性なしであらゆる実験室で行うことができる。さらに、C.エレガンス培養から過熱基準を抽出するフォルチ法の改変について説明する。最後に、安定な同位体標識アナログ1-AG-d5を用いて2-AGを検出する定量的および分析的方法について説明し、高速クロマトグラフィー実行で信頼性の高い結果を提供する。この手順は、異なる生物における代謝産物の他の研究にも適用可能である一方で、C.エレガンスにおける2-AGの複数の役割を研究するのに有用である。
Introduction
エンドカンナビノイドは、様々な生物の中で複数の生物学的プロセスを調節し、脂質メディエーター1を保存している。最初に発見され、最もよく特徴付けられたエンドカンナビノイドは、アナンダミド(アラキドノエレタノールアミド、AEA)および2-アラキドノイルグリセロール(2-AG)である。エンドカンナビノイドは、脳報酬システムだけでなく、薬物中毒、記憶、気分、代謝プロセス2に関与するものを含む多くの重要な役割を果たしています。AEAおよび2-AGは必要なときだけ合成され、短い寿命を持ち、輸送タンパク質の再取り込みおよび加水分解3によって分解される。
カエノルハブ炎エレガンス(C.エレガンス)のような動物モデルの使用は、アポトーシス、細胞シグナル伝達、細胞周期、細胞極性、遺伝子調節、代謝、老化を含む多種多様な生物学的プロセスを研究することが重要になっています。と性決定4,5.さらに、C.エレガンスは多価不飽和脂肪酸(PUFA)の生理的役割を研究するための優れたモデルです。AEAはC.エレガンスで同定され、食事制限6の下で減少する。この欠乏は、内因性カンナビノイドの補充によって抑制することができる食事制限メカニズムを介して線虫の寿命を延ばす.最近、2-AGとAEAがC.エレガンス7におけるコレステロール密売の規制において基本的な役割を果たしていることが判明した。さらに重要なことは、外因性2-AGによる補充は、ニーマンピックタイプC1 C.エレガンス変異体におけるコレステロールの密売障害によって引き起こされるダウアー逮捕を救うことができると判断された。
線虫内のコレステロールの密売やその他の生物学的プロセス(すなわち、単一アミノ化作動性シグナル伝達、非cicepepingおよび移動)との2-AGの関係をより深く理解するためには、この内因性代謝産物とその方法を研究することが重要である。特定の環境および食事条件の下で影響を受ける8,9,10,11,12,13.したがって、異なる分野の科学者、特にこれに関連して線虫の行動を研究する人にとって使いやすいC.エレガンスの内因性2-AGを検出し、定量する方法を設計し、最適化することが不可欠です。エンドカンナビノイド。
2008年、レトネンと同僚は、LC-MS分析方法14を用いてC.エレガンスの2-AGおよびAEAを同定することに成功した。2011年に、彼らは他のエンドカンナビノイド15にこの技術を拡大することができました。より最近の研究は、質量分析およびGC-MS16、17、18を含むC.エレガンスにおけるエンドカンナビノイドの検出と定量化に成功した他の分析方法を示しており、同様の分析方法が他のモデル19に拡張できることも報告されている。
生物学的試料中の2-AGを定量するために使用される以前に報告された分析方法は、通常、商業的に取得され、購入20、21の可用性を必要とする過形規格の使用を伴う。エンドカンナビノイドのLC-MS/MS定量のための多くの分析基準は、異なるプロバイダから市販されています。それにもかかわらず、それらは高価であり、敏感であり、複数の二重結合の存在のために、時間の経過とともに酸化される。これらの標準の最も一般的なバージョンは、オクタ割溶化アラキドン酸に基づいており、同位体希釈LC-MS/MS14、22による定量に適しています。また、これらの標準のほとんどは、グリセロールの位置2に置き換え、彼らはアシル移行19、23に傾向があるので、ほとんどの条件下で不安定になります。
これらの過熱規格のコストおよび安定性に関連する困難を克服するために、グリセロールd5に基づいて分析標準を調製するための便利で簡単な方法が提示される。ペンタ割り当て標準を調製する順序は、標準の1-AG-d5をもたらす3段階の手順を必要とし、これは安定しており、アシル移行を受けていない(2-モノアシルグリセロールの合成を目指す場合の主な問題)。
ここでの主な目的は、分析的過熱規格の合成、線虫サンプルの調製と抽出、LC-MS/MSによる分析を含む、C.エレガンスにおける2-AGを研究するための簡単で再現性の高い方法を示す(図1)).この合成手順は、高度な有機合成知識や特殊な装置なしで達成可能であり、内因性カンナビノイドの影響下でC.エレガンスの行動を研究している異なる分野の科学者に適しています。この方法は他のスタディモデルにも拡張可能で、異なるターゲットに役立ちます。ここで報告されているように、この規格は、再現可能な方法で2-AGの効果的な検出と定量を可能にする高速で信頼性の高いクロマトグラフィー法の開発に成功するために適用されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
エンドカンナビノイドは、C.エレガンス7におけるダウアー形成の調節に関与している脂質のクラスである。より具体的には、多価不飽和脂肪酸(PUFA)の合成は、コレステロールの密売およびワームの生殖発達にとって重要である。2-AG、エンドカンナビノイドを含むアラキドン酸は、コレステロール代謝を損なったワームの通常のサイクルにダウアー幼虫を回復させる責…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、アジェンシア・ナシオナル・デ・プロモシオン・シエンティフィカ・イ・テクノロジカ(ANPCyT, PICT 2014-3693)からの研究助成金によって支援されました。J.F.d.L.、G.P.、B.H.C.はコニストの仲間です。D.d.M.とG.R.L.は、コニストのリサーチキャリアのメンバーです。私たちは、LC-MS/MS分析と有益な議論のためのゴンサロ・ランベルト(INMET)に感謝しています。ビデオ撮影と編集は、ラミロ・オルテガとマリア・ソレダ・カサソラによって行われました ディレクシオン・デ・コムニカシオン・デ・ラ・シエンシア、ファカルタ・デ・シエンシア・ポリティカ・イ・レラシオネス・インターナショナル、ロサリオのナシオナル・デ・ロサリオ大学。
Materials
| 4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
| antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
| tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
| UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
References
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