Sintesi di uno standard deuterato per la quantificazione di 2-Arachidonoylglycerol a Caenorhabditis elegans
Summary
Questo lavoro descrive un metodo robusto e diretto per rilevare e quantificare l’endocannabinoide 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in C. elegans. Uno standard analitico deuterato che abbiamo preparato e utilizzato per la quantificazione di 2-AG da diluizione isotopica e cromatografia liquida-elettrospray-spettrometria di massa di mitinazione -tandem (LC-ESI-MS/MS).
Abstract
Questo lavoro presenta un metodo per preparare uno standard analitico per analizzare la glicerel 2-aracidonoyl (2-AG) qualitativamente e quantitativamente mediante cromatografia liquida-elettrospray ionization-tandem spettrometria di massa (LC-ESI-MS/MS). Gli endocannabinoidi sono conservati mediatori lipidici che regolano più processi biologici in una varietà di organismi. In C. elegans, 2-AG è stato trovato per possedere ruoli diversi, tra cui la modulazione della formazione di dauer e metabolismo del colesterolo. La presente relazione descrive un metodo per superare le difficoltà associate ai costi e alla stabilità degli standard deuterati necessari per la quantificazione dei 2 AG. La procedura per la sintesi dello standard è semplice e può essere eseguita in qualsiasi laboratorio, senza la necessità di competenze di sintesi organica o di attrezzature speciali. Inoltre, viene descritta una modifica del metodo di Folch per estrarre lo standard deuterato dalla cultura di C. elegans. Infine, viene descritto un metodo quantitativo e analitico per rilevare 2-AG utilizzando l’analogico 1-AG-d5 etichettato isotopicamente stabile, che fornisce risultati affidabili in una corsa fast-cromatica. La procedura è utile per studiare i molteplici ruoli di 2-AG in C. elegans, pur essendo applicabile ad altri studi di metaboliti in organismi diversi.
Introduction
Gli endocannabinoidi regolano i processi biologici multipli in una varietà di organismi e sono conservati mediatori lipidici1. I primi endocannabinoidi scoperti e più caratterizzati sono l’anandamide (arachidonoylethanolamide, AEA) e il glicerolo 2-arachidonoyl (2-AG). Gli endocannabinoidi svolgono molti ruoli critici, compresi quelli coinvolti nei sistemi di ricompensa del cervello, nonché la tossicodipendenza, la memoria, l’umore e i processi metabolici2. AEA e 2-AG sono sintetizzate solo quando necessario e hanno una breve durata di vita, e sono degradate attraverso la ricarica delle proteine di trasporto e l’idrolisi3.
L’uso di modelli animali come Caenorhabditis elegans (C. elegans) è diventato importante per studiare la grande varietà di processi biologici tra cui l’apoptosi, la segnalazione cellulare, il ciclo cellulare, la polarità cellulare, la regolazione genica, il metabolismo, l’invecchiamento, e determinazione del sesso4,5. Inoltre, C. elegans è un ottimo modello per studiare i ruoli fisiologici degli acidi grassi polinsaturi (PUFA). AEA è stato identificato in C. elegans ed è ridotto sotto la restrizione dietetica6. Questa carenza estende la durata della vita del nematode attraverso un meccanismo di restrizione dietetica che può essere soppresso dal completamento con l’endocannabinoide. Recentemente, si è scoperto che 2-AG e AEA svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione del traffico di colesterolo in C. elegans7. Ancora più importante, è stato determinato che il completamento con esogeno 2-AG può salvare l’arresto dauer, che è causato dal traffico di colesterolo alterato nei mutanti Niemann-Pick tipo C1 C. elegans.
Per comprendere meglio il rapporto tra 2-AG e il traffico di colesterolo e altri processi biologici nel nematode (ad es. segnalazione monoaminergica, nociception e locomozione), è fondamentale studiare questo metabolita endogeno e come in determinate condizioni ambientali e dietetiche8,9,10,11,12,13. Pertanto, è imperativo progettare e ottimizzare un metodo per rilevare e quantificare endogeno 2-AG in C. elegans che è semplice da usare per gli scienziati di diversi campi, in particolare quelli che studiano il comportamento del nematode in relazione a questo Endocannabinoide.
Nel 2008, Lethonen e i colleghi sono riusciti a identificare 2-AG e AEA in C. elegans utilizzando metodi analitici LC-MS14. Nel 2011 sono riusciti ad espandere questa tecnica ad altri endocannabinoidi15. Un lavoro più recente ha dimostrato altri metodi analitici che sono riusciti a rilevare e quantificare gli endocannabinoidi in C. elegans, tra cui la spettrometria di massa e GC-MS16,17,18, e ha è stato inoltre segnalato che metodi analitici simili possono essere ampliati ad altri modelli19.
I metodi analitici precedentemente riportati utilizzati per quantificare 2-AG in campioni biologici di solito comportano l’uso di standard deuterati che sono acquisiti commercialmente e richiedono disponibilità per l’acquisto20,21. Molti standard analitici per la quantificazione LC-MS/MS degli endocannabinoidi sono disponibili in commercio da diversi fornitori. Tuttavia, sono costosi, sono sensibili e si ossidano nel tempo, a causa della presenza di più obbligazioni doppie. Le versioni più comuni di questi standard sono basate sull’acido aracidonico ottuerato e sono adatte per la quantificazione mediante diluizione isotopica LC-MS/MS14,22. Inoltre, la maggior parte di questi standard sono sostituiti nella posizione 2 del glicerolo, rendendoli instabili nella maggior parte delle condizioni in quanto sono inclini alla migrazione acyl19,23.
Per superare le difficoltà concuite con i costi e la stabilità di questi standard deuterati, viene presentato un metodo comodo e semplice per preparare uno standard analitico basato sul glicerol-d5. La sequenza per preparare lo standard penta-deuterato richiede una procedura in tre fasi che si traduce nello standard 1-AG-d5, che è stabile e non subisce la migrazione acyl (il problema principale quando si mira a sintetizzare 2 monoacylglyceroli).
L’obiettivo principale qui è quello di mostrare un metodo semplice e riproducibile per studiare 2-AG in C. elegans, compresa la sintesi dello standard analitico deuterato, la preparazione e l’estrazione dei campioni di nematodi, e l’analisi da LC-MS/MS(Figura 1 ). Questa procedura sintetica è realizzabile senza la sofisticata conoscenza di sintesi organica o attrezzature speciali, che lo rende adatto per gli scienziati provenienti da diversi campi che stanno studiando il comportamento di C. elegans sotto l’influenza endocannabinoide. Il metodo è anche espandibile ad altri modelli di studio, rendendolo utile per diversi obiettivi. La norma, preparata come riportato qui, è stata applicata per sviluppare con successo un metodo cromatico veloce e affidabile che consente un rilevamento e una quantificazione efficaci di 2-AG in modo riproducibile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli endocannabinoidi sono una classe di lipidi che sono stati implicati nella regolazione della formazione di dauer in C. elegans7. Più specificamente, la sintesi di acidi grassi polinsaturi (PUFA) è importante per il traffico di colesterolo e lo sviluppo riproduttivo dei vermi. Si rivela qui che 2-AG, un acido arachidonico contenente endocannabinoidi, è responsabile della restituzione della larva dauer al suo ciclo normale in vermi che hanno alterato il metabolismo del colesterolo<sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione di ricerca dell’Agencia Nacional de Promociàn Cient-fica y Tecnol’gica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P., e B.H.C. sono compagni di CONICET. D.d.M. e G.R.L. sono membri della Carriera di ricerca di CONICET. Siamo grati a Gonzalo Lamberto (INMET) per l’analisi LC-MS/MS e una discussione utile. Le riprese e l’editing video sono state effettuate da Ramiro Ortega e Maria Soledad Casasola di Direcciàn de Comunicaciàn de la Ciencia, Facultad de Ciencia Poàtica y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario a Rosario, Argentina.
Materials
| 4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
| antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
| tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
| UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
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