Synthese eines deuterated Standards zur Quantifizierung von 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans
Summary
Diese Arbeit beschreibt eine robuste und unkomplizierte Methode, um das Endocannabinoid 2-Arachidonoylglycerol (2-AG) in C. eleganszu erkennen und zu quantifizieren. Ein analytischer deuterated Standard hat wir vorbereitet und für die Quantifizierung von 2-AG durch Isotopverdünnung und Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS) verwendet.
Abstract
Diese Arbeit stellt eine Methode zur Vorbereitung eines analytischen Standards zur qualitativen und quantitativen Analyse von 2-Arachidonoylglycerol (2-AG) durch Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS) dar. Endocannabinoide sind konservierte Lipidmediatoren, die mehrere biologische Prozesse in einer Vielzahl von Organismen regulieren. Bei C. elegans, 2-AG wurde festgestellt, dass verschiedene Rollen besitzen, einschließlich Modulation der Dauerbildung und Cholesterinstoffwechsel. Dieser Bericht beschreibt eine Methode, um die Schwierigkeiten zu überwinden, die mit den Kosten und der Stabilität der deuterated Standards verbunden sind, die für die Quantifizierung der 2-AG erforderlich sind. Das Verfahren zur Synthese der Norm ist einfach und kann in jedem Labor durchgeführt werden, ohne dass organische Synthese-Expertise oder spezielle Ausrüstung erforderlich ist. Darüber hinaus wird eine Änderung der Folch-Methode beschrieben, um den deuterated Standard aus der C. elegans-Kultur zu extrahieren. Schließlich wird eine quantitative und analytische Methode zur Detektion von 2-AG mit dem stabilen isotopisch beschrifteten Analog 1-AG-d5 beschrieben, das zuverlässige Ergebnisse in einem schnell-chromatographischen Lauf liefert. Das Verfahren ist nützlich, um die vielfältigen Rollen der 2-AG in C. elegans zu untersuchen und gleichzeitig auf andere Untersuchungen von Metaboliten in verschiedenen Organismen anwendbar zu sein.
Introduction
Endocannabinoide regulieren mehrere biologische Prozesse in einer Vielzahl von Organismen und sind konservierte Lipidmediatoren1. Die ersten entdeckten und am besten charakterisierten Endocannabinoide sind Anandamid (Arachidonoylethanolamid, AEA) und 2-Arachidonoylglycerol (2-AG). Endocannabinoide spielen viele kritische Rollen, einschließlich derer in Gehirn BelohnungSysteme sowie Drogenabhängigkeit beteiligt, Speicher, Stimmung, und Stoffwechselprozesse2. AEA und 2-AG werden nur bei Bedarf synthetisiert und haben kurze Lebensdauern, und sie werden durch Transportproteinrückaufnahme und Hydrolyse3abgebaut.
Die Verwendung von Tiermodellen wie Caenorhabditis elegans (C. elegans) ist wichtig geworden, um die große Vielfalt biologischer Prozesse zu untersuchen, einschließlich Apoptose, Zellsignalisierung, Zellzyklus, Zellpolarität, Genregulation, Stoffwechsel, Alterung, und Geschlechtsbestimmung4,5. Darüber hinaus ist C. elegans ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung der physiologischen Rollen von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs). AEA wurde in C. elegans identifiziert und wird unterDiät-Beschränkung6 reduziert. Dieser Mangel verlängert die Lebensdauer der Nematode durch einen diätetischen Restriktionsmechanismus, der durch Supplementierung mit dem Endocannabinoid unterdrückt werden kann. Kürzlich wurde entdeckt, dass 2-AG und AEA eine grundlegende Rolle bei der Regulierung des Cholesterinhandels in C. elegans7spielen. Noch wichtiger war, dass die Supplementierung mit exogenen 2-AG dauer arrest retten kann, die durch den beeinträchtigten Cholesterinhandel bei Niemann-Pick Typ C1 C. elegans Mutanten verursacht wird.
Um ein besseres Verständnis der Beziehung der 2-AG zum Cholesterinhandel und anderen biologischen Prozessen im Nematode (d. h. monoaminergische Signalisierung, Nozieption und Fortbewegung) zu erlangen, ist es entscheidend, diesen endogene Metaboliten zu untersuchen und wie er unter bestimmten Umwelt- und Ernährungsbedingungen betroffen8,9,10,11,12,13. Daher ist es unerlässlich, eine Methode zur Erkennung und Quantifizierung von endogenen 2-AG in C. elegans zu entwerfen und zu optimieren, die für Wissenschaftler verschiedener Bereiche einfach zu verwenden ist, insbesondere für diejenigen, die das Verhalten der Nematode in Bezug auf diese Endocannabinoid.
2008 gelang es Lethonen und Kollegen, 2-AG und AEA in C. elegans mit LC-MS-Analysemethoden zu identifizieren14. Im Jahr 2011 gelang es ihnen, diese Technik auf andere Endocannabinoide zu erweitern15. Neuere Arbeiten haben andere analytische Methoden gezeigt, die erfolgreich bei der Detektion und Quantifizierung von Endocannabinoiden in C. elegans,einschließlich Massenspektrometrie und GC-MS16,17,18, und es hat es wurde auch berichtet, dass ähnliche Analysemethoden auf andere Modelle erweitert werden können19.
Zuvor gemeldete Analysemethoden zur Quantifizierung von 2-AG in biologischen Proben beinhalten in der Regel die Verwendung von deuterated Standards, die kommerziell erworben werden und Verfügbarkeit für den Kauf erfordern20,21. Viele analytische Standards für die LC-MS/MS-Quantifizierung von Endocannabinoiden sind von verschiedenen Anbietern kommerziell erhältlich. Dennoch sind sie teuer, sind empfindlich und oxidieren im Laufe der Zeit, aufgrund des Vorhandenseins mehrerer Doppelbindungen. Die gängigsten Versionen dieser Normen basieren auf der octa-deuterated arachidonsäure und sind für die Quantifizierung durch Isotopverdünnung LC-MS/MS14,22geeignet. Auch, die meisten dieser Standards sind in Position 2 des Glycerins ersetzt, so dass sie unter den meisten Bedingungen instabil sind, da sie anfällig für Acylmigrationsind 19,23.
Um die Schwierigkeiten zu überwinden, die mit den Kosten und der Stabilität dieser deuterated Standards verbunden sind, wird eine bequeme und einfache Methode zur Vorbereitung eines analytischen Standards auf der Grundlage von Glycerin-d5vorgestellt. Die Reihenfolge zur Vorbereitung des penta-deuterated-Standards erfordert ein dreistufiges Verfahren, das zu dem Standard 1-AG-d5führt, das stabil ist und keiner Acylmigration unterzogen wird (das Hauptproblem bei der Synthese von 2-Monoacylglycerolen).
Das Hauptziel besteht darin, eine einfache und reproduzierbare Methode zur Untersuchung von 2-AG in C. eleganszu zeigen, einschließlich der Synthese des analytischen deuterated Standards, der Herstellung und Extraktion der Nematodenproben und der Analyse durch LC-MS/MS (Abbildung 1 ). Dieses synthetische Verfahren ist ohne das ausgeklügelte organische Synthesewissen oder spezielle Ausrüstung erreichbar, so dass es für Wissenschaftler aus verschiedenen Bereichen geeignet ist, die das Verhalten von C. elegans unter endocannabinoidem Einfluss untersuchen. Die Methode ist auch auf andere Studienmodelle erweiterbar, was sie für verschiedene Ziele nützlich macht. Die hier erstellte Norm wurde angewendet, um erfolgreich ein schnelles und zuverlässiges chromatographisches Verfahren zu entwickeln, das eine effektive Detektion und Quantifizierung von 2-AG in reproduzierbarer Weise ermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endocannabinoide sind eine Klasse von Lipiden, die in die Regulierung der Dauerbildung in C. elegans7verwickelt sind. Genauer gesagt ist die Synthese von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs) wichtig für den Cholesterinhandel und die fortpflanzungsfördernde Entwicklung von Würmern. Hier zeigt sich, dass 2-AG, eine Arachidonsäure, die Endocannabinoid enthält, für die Wiederherstellung der Dauerlarve in ihrem normalen Zyklus bei Würmern verantwortlich ist, die den Cholesterinst…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium der Agencia Nacional de Promocién Cientéfica y Tecnol-gica (ANPCyT, PICT 2014-3693) unterstützt. J.F.d.L., G.P. und B.H.C. sind Fellows von CONICET. D.d.M. und G.R.L. sind Mitglieder der Forschungskarriere von CONICET. Wir danken Gonzalo Lamberto (INMET) für die LC-MS/MS Analyse und hilfreiche Diskussion. Die Videoaufnahmen und -bearbeitungen wurden von Ramiro Ortega und Maria Soledad Casasola von Direccién de Comunicacién de la Ciencia, Facultad de Ciencia Polética y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario in Rosario, Argentinien, durchgeführt.
Materials
| 4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
| antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
| tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
| UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
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