Questo protocollo descrive un setup originale che combina misurazioni spettrali e di durata di fluorescenza per valutare il trasferimento di energia di risonanza di F ‘rster (FRET) tra sonde fluorescenti a base di rhodamina e polimero di lignina direttamente nelle sezioni di spessore dell’impianto.
Nella biomassa lignocellulosica (LB), l’attività degli enzimi è limitata dalla comparsa di interazioni non specifiche con la lignina durante il processo di idrolisi, che mantiene gli enzimi lontani dal loro substrato. La caratterizzazione di queste interazioni complesse è quindi una sfida in substrati complessi come LB. Il metodo qui misura le interazioni molecolari tra molecole con marcafluno e lignina autofluorescente nativa, che sarà rivelata dal trasferimento di energia di risonanza del Fàrster (FRET). Contrariamente alle misurazioni FRET nelle cellule viventi che utilizzano due fluorofori esogeni, le misurazioni FRET nelle piante che utilizzano la lignina non sono banali a causa della sua complessa autofluorescenza. Abbiamo sviluppato una pipeline di acquisizione e analisi originale con l’osservazione correlata di due proprietà complementari della fluorescenza: l’emissione di fluorescenza e la durata. sFLIM (microscopia di imaging a vita spettrale e fluorescente) fornisce la quantificazione di queste interazioni con alta sensibilità, rivelando diversi livelli di interazione tra biomolecole e lignina.
Lignocellulosa idrolgona in zuccheri monomerici come il glucosio richiede enzimi. La loro attività è nota per essere contenuta nella creazione di interazioni non specifiche tra enzimi e lignina1,2, quest’ultima è un polimero idrofobico e un importante costituente della lignocellulosa3. Pertanto, misurare quantitativamente tali interazioni direttamente su scala cellulare è una sfida che deve essere affrontata per ottimizzare l’attività catalitica enzimatica e il pretrattamento della lignocellulosa4.
La misurazione del trasferimento di energia di risonanza (FRET) di Fàrster (o fluorescenza) è un metodo di scelta per valutare l’interazione delle biomolecole in situ. Questo trasferimento di energia non radiativa può verificarsi tra un donatore e un fluoroforo accettatore se soddisfano condizioni diverse. Lo spettro di emissione del donatore deve sovrapporsi, almeno in parte, allo spettro di eccitazione degli accettanti. La scelta dei fluorofori è quindi cruciale per tali esperimenti. Quindi, l’efficienza di trasferimento diminuisce con la sesta potenza della loro distanza5 e si verifica solo se entrambe le molecole sono nelle immediate vicinanze (tipicamente nella gamma nanometrica). Altre contingenze possono alterare l’efficienza di trasferimento, come l’orientamento del dipolo-dipolo, ma sono attenuate se i fluorofori hanno flessibilità.
FRET può essere misurato con diverse tecniche e descrizioni dettagliate possono essere trovate nella letteratura6,7. In breve, i metodi principali si basano su: i) emissioni sensibilizzate in cui viene seguita la variazione della fluorescenza delle emissioni accettanti e fornisce risultati principalmente qualitativi; ii) il fotosbiancamento dell’accettatore in cui la fluorescenza delle emissioni del donatore viene misurata prima e dopo il fotosbleaching dell’accettazione (in questo caso, è possibile ottenere stime FRET più precise, ma richiedono una forte potenza laser applicata a campioni fissi); e iii) misurazione della durata che diminuisce per il donatore in presenza dell’accettatore. Questo metodo richiede strumenti specifici e consente misurazioni di interazione precise e sensibili tra fluorofori. Considerando la misura FRET tra sonde fluorescenti e lignocellulosa, la difficoltà principale è che la lignocellulosa non è un singolo fluoroforo nativo e spettrale, proveniente principalmente dalla lignina e dipendente dalla biomassa8,9.
In questo documento, proponiamo una procedura nuova e originale adattata a sezioni di campioni di legno / piante. Questo metodo basato su sFLIM apre la strada alle misurazioni quantitative di FRET tra sonde fluorescenti e lignina in campioni nativi di lignocellululosa.
La correlazione della durata della fluorescenza e le misurazioni dello spettro di emissione consentono di combinare i vantaggi di entrambi i metodi. In effetti, le misurazioni spettrali da sole mancano di sensibilità e rimangono qualitative. D’altra parte, la durata della fluorescenza è il metodo di scelta per le tradizionali misurazioni quantitative freT, ma è stato dimostrato che lignina autofluorescenza potrebbe variare a seconda della composizione e dell’ambiente lignina16. Pertanto, le interazioni di lignina con un accettatore o le modifiche strutturali della lignina non possono essere discriminate in quanto entrambe comportano una diminuzione della vita. Come dimostrato, il metodo sviluppato fornisce una misurazione inequivocabile, sensibile e quantitativa delle interazioni tra molecole di lignina e accettatore nelle sezioni vegetali. Anche se le diverse fasi del metodo sono state rigorosamente ottimizzate, è necessario prestare particolare attenzione per i seguenti punti.
Per quanto riguarda i campioni, la qualità della sezione dell’impianto è fondamentale per garantire l’imaging a fuoco. I diversi passaggi per l’incorporamento peg devono essere rigorosamente seguiti. La fase finale di lavaggio è essenziale per evitare interferenze dal PEG rimanente nei campioni. Inoltre, la concentrazione del buffer e il pH devono essere mantenuti rigorosamente identici per tutte le misurazioni, poiché qualsiasi cambiamento può avere un forte impatto sulle proprietà di fluorescenza.
Anche la misurazione a vita può essere delicata. La durata della fluorescenza del donatore può essere instabile, ad esempio a causa di un’alta eccitazione. In tal caso, la messa a punto della potenza del laser e dello zoom può risolvere il problema. Un’altra fonte ben nota di artefatti nelle misurazioni TCSPC è il pile-up dell’impulso fotonico. Infatti, TCSPC non è in grado di misurare la velocità di due fotoni emessi tra gli stessi due impulsi laser. Mentre i campioni di piante sono altamente strutturati, la fluorescenza non è omogenea e può portare a un effetto di pileup nascosto. Mentre il numero di fotoni al secondo rimane al di sotto del limite di eccitazione dell’1%, può essere più alto in alcune aree campione. Per garantire nessun esperimento di pileup, è possibile considerare la misurazione della durata della fluorescenza del donatore con un flusso di fotoni diversi. Se la durata aumenta mentre il flusso diminuisce, un effetto pileup sta alterando le misure. Il flusso di fotoni ottimale viene raggiunto con la stabilità della vita del donatore.
Per quanto riguarda l’analisi della curva di decadimento sFLIM, si consiglia di basarsi su ogni singola curva adatta per garantire che il modello descriva accuratamente le misurazioni. In caso contrario, assicurarsi innanzitutto che nessuno degli artefatti menzionati in precedenza abbia danneggiato i dati. Quindi, il passaggio 2.1.4 fornisce la funzione di risposta strumentale (IRF) del sistema. Se IRF presenta alcune anomalie, ottimizzare il percorso ottico per ridurle al minimo. È inoltre possibile utilizzare un IRF misurato per l’adattamento durante la fase 6.2. Infine, i gradi di libertà del modello di adattamento possono essere aumentati a un decadimento a tre esponenziali nel passaggio 6.2. Tuttavia, il numero di fotoni necessari per la determinazione della vita individuale e della proporzione è elevato e si raccomanda quindi di utilizzarli solo per ottenere una durata media più stabile dal passaggio 6.4. Informazioni più esaustive su FLIM, la sua caratterizzazione18, sFLIM e la sua applicazione12 in particolare alla lignina10, possono essere trovate nella letteratura.
Sebbene impegnativa, la misurazione del FRET nei tessuti delle piante che utilizzano l’autofluorescenza nativa mostra alcuni vantaggi. Rispetto alle misurazioni FRET eseguite su tessuti viventi in cui gli studi di interazione tra biomolecole spesso richiedono ingegneria genetica per esprimere marcatori fluorescenti intrinseci, tessuti vegetali lignificati come quelli qui presentati, offrono l’autofluorescenza e le sonde fluorescenti del partner estrinseca possono essere facilmente aggiunte, risparmiando molto tempo. Tuttavia, a seconda delle specie vegetali analizzate e dei possibili pretrattamenti effettuati, è probabile che l’autofluorescenza venga modificata, in modo che debba essere caratterizzata con cura e il fluoroforo utilizzato come sonde potrebbe dover essere adattato.
Il metodo sFLIM deve essere applicato alle sonde fluorescenti prive di attività catalitica (PEG e dextran). Nel quadro dell’idrolisi di lignocellulosa vegetale, potrebbero essere eseguite interazioni di enzimi in vari campioni di biomassa, con conseguente determinazione dell’impatto della localizzazione (cellule e tessuti) sulla forza di interazione. Il successivo passaggio di ottimizzazione sarà l’automazione del passaggio di analisi. Infatti, con abbastanza dati analizzati, potrebbe essere implementata una procedura di analisi basata sull’apprendimento automatico per l’analisi automatizzata del fenotipo, che aumenterebbe la sua amenabilità per un rapido screening dell’efficienza enzimatica-biomassa. Inoltre, sFLIM non richiede la fissazione del campione e può essere facilmente applicato agli studi dinamici di interazione enzimatica-lignina. Un metodo così unico probabilmente guiderà la strategia di ingegneria degli enzimi e il pretrattamento della biomassa per ottimizzare la valorizzazione della lignocellulosa.
The authors have nothing to disclose.
Fanny Laurent (FARE) è ringraziata calorosamente per la preparazione delle figure. La Federazione di ricerca FRABio (Università di Lille, CNRS) è riconosciuta per aver fornito l’ambiente tecnico favorevole al raggiungimento di questo lavoro. I finanziamenti sono stati ottenuti dall’Agenzia nazionale francese per la ricerca (progetto LIGNOPROG ANR-14-CE05-0026).
Confocal microscope | ZEISS | LSM 710 NLO | for confocal imaging |
fine brush | to collect sections | ||
glass vials | for incubations | ||
high precision microscope cover glasses 170+/-5µm n°1,5# | Marienfeld | 0107032 | saled by Dutscher s.a in France |
Infra-red pulsed laser | COHERENT | CHAMELEON VISION | For sample excitation |
Micropipette Research Plus monocanal 20-200µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Micropipette Research Plus monocanal 2-20µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end | Thermo Fisher Scientific | LR45D | |
microtome blades disposable (pack of 50) | Agar Scientific | T5024 | saled by Oxford Instruments in France |
mPEG-Rhodamine, 10 kDa | Creative Peg Works | PSB-2263 | |
mPEG-Rhodamine, 20 kDa | Creative Peg Works | PSB-22642 | |
mPEG-Rhodamine, 5 kDa | Creative Peg Works | PSB-2264 | |
nail polish | for mounting | ||
pH meter five easy plus | Mettler toledo | FEP20 | with electrode |
poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450 | Merck (sigma-Aldrich) | P5402-1kg | for sample embedding |
razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100 | Agar Scientific | T586 | for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France |
rotary microtome | Microm Microtech | HM 360 | |
sFLim detector | BECKER-HICKL | SPC 150 | for lifetime acquisition |
sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 71500 | for buffer solution |
sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 30435-1kg | for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg |
tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da | Merck (sigma-Aldrich) | R8881-100mg |