Ce protocole décrit une configuration originale combinant des mesures spectrales et fluorescence à vie pour évaluer le transfert d’énergie de résonance (FRET) entre les sondes fluorescentes à base de rhodamine et le polymère de lignine directement dans d’épaisses sections végétales.
Dans la biomasse lignocellulosique (LB), l’activité des enzymes est limitée par l’apparition d’interactions non spécifiques avec la lignine pendant le processus d’hydrolyse, qui maintient les enzymes loin de leur substrat. La caractérisation de ces interactions complexes est donc un défi dans des substrats complexes tels que lb. La méthode mesure ici les interactions moléculaires entre les molécules étiquetées au fluorophore et la lignine autofluorescente indigène, qui seront révélées par le transfert d’énergie de résonance de La Rster (FRET). Contrairement aux mesures FRET dans les cellules vivantes utilisant deux fluorophores exogènes, les mesures FRET chez les plantes utilisant la lignine ne sont pas négligeables en raison de son autofluorescence complexe. Nous avons développé un pipeline d’acquisition et d’analyse original avec l’observation corrélée de deux propriétés complémentaires de fluorescence : l’émission de fluorescence et la durée de vie. sFLIM (microscopie d’imagerie à vie spectrale et fluorescente) fournit la quantification de ces interactions avec une sensibilité élevée, révélant différents niveaux d’interaction entre les biomolécules et la lignine.
Hydrolysant la lignocellulose en sucres monomériques tels que le glucose nécessite des enzymes. Leur activité est connue pour être limitée par l’établissement d’interactions non spécifiques entre les enzymes et la lignine1,2, ce dernier étant un polymère hydrophobe et un constituant majeur de la lignocellulose3. Ainsi, la mesure quantitative de ces interactions directement à l’échelle cellulaire est un défi qui doit être abordé pour optimiser l’activité catalytique enzymatique et le prétraitement de la lignocellulose4.
La mesure du transfert d’énergie par résonance (FRET) est une méthode de choix pour mesurer l’interaction des biomolécules in situ. Ce transfert d’énergie non radiatif peut se produire entre un donneur et un fluorophore accepteur s’ils remplissent des conditions différentes. Le spectre des émissions des donateurs doit chevaucher, au moins partiellement, le spectre d’excitation des accepteurs. Le choix des fluorophores est donc crucial pour de telles expériences. Ensuite, l’efficacité du transfert diminue avec la sixième puissance de leur distance5 et ne se produit que si les deux molécules sont à proximité (généralement dans la gamme nanométrique). D’autres éventualités peuvent modifier l’efficacité du transfert, comme l’orientation dipole-dipole, mais sont atténuées si les fluorophores ont de la flexibilité.
FRET peut être mesurée par différentes techniques et des descriptions détaillées peuvent être trouvées dans la littérature6,7. En bref, les principales méthodes s’appuient sur : i) émission sensibilisée dans laquelle la variation de la fluorescence des émissions d’accepteurs est suivie et fournit principalement des résultats qualitatifs; ii) le photoblanchiment d’accepteur dans lequel la fluorescence d’émission de distributeur est mesurée avant et après le photoblanchiment d’accepteur (dans ce cas, des estimations plus précises de FRET peuvent être réalisées mais exigent la puissance laser forte appliquée aux échantillons fixes); iii) la mesure à vie qui diminue pour le donneur en présence de l’accepteur. Cette méthode nécessite des instruments spécifiques et permet des mesures d’interaction précises et sensibles entre les fluorophores. Compte tenu de la mesure FRET entre les sondes fluorescentes et la lignocellulose, la principale difficulté est que la lignocellulose n’est pas un seul fluorophore bien caractérisé: il a une forte autofluorescence indigène et à l’échelle spectrally, principalement provenant de lignine, et dépendant de l’espèce de biomasse8,9.
Dans cet article, nous proposons une procédure nouvelle et originale adaptée à des sections d’échantillons de bois/plantes. Cette méthode basée sur sFLIM ouvre la voie à des mesures quantitatives fret entre les sondes fluorescentes et la lignine dans les échantillons de lignocellulose indigène.
Les mesures de la durée de vie de la fluorescence et du spectre d’émission permettent de combiner les avantages des deux méthodes. En effet, les mesures spectrales manquent à elles seules de sensibilité et restent qualitatives. D’autre part, la durée de vie de fluorescence est la méthode de choix pour les mesures quantitatives traditionnelles fret, mais il a été démontré que l’autofluorescence de lignine pourrait varier en fonction de la composition de lignine et de l’environnement16. Ainsi, les interactions de lignine avec un accepteur ou des changements structurels de lignine ne peuvent pas être discriminées puisqu’elles ont toutes deux comme conséquence une diminution de vie. Comme nous l’avons démontré, la méthode développée fournit une mesure claire, sensible et quantitative des interactions entre les molécules de lignine et d’accepteur dans les sections végétales. Même si les différentes étapes de la méthode ont été rigoureusement optimisées, la prudence doit être particulièrement prise pour les points suivants.
En ce qui concerne les échantillons, la qualité de la section de l’usine est essentielle pour assurer l’imagerie en cours d’orientation. Les différentes étapes pour l’intégration PEG doivent être strictement suivies. L’étape finale de lavage est essentielle pour s’assurer qu’aucune interférence du PEG ne reste dans les échantillons. En outre, la concentration et le pH de tampon devraient être strictement identiques pour toutes les mesures puisque tout changement peut avoir un impact fort sur des propriétés de fluorescence.
La mesure à vie peut également être délicate. La durée de vie de fluorescence du donneur peut être instable, par exemple en raison d’une excitation élevée. Dans un tel cas, l’adage de la puissance laser et le zoom peut résoudre le problème. Une autre source bien connue d’artefacts dans les mesures du TCSPC est le carambolage des impulsions de photons. En effet, TCSPC ne peut pas mesurer la vitesse de deux photons émis entre les deux mêmes impulsions laser. Bien que les échantillons de plantes soient très structurés, la fluorescence n’est pas homogène et peut entraîner un effet de carambolage caché. Bien que le nombre de photons par seconde reste inférieur à la limite d’excitation de 1 %, il peut être plus élevé dans certaines zones d’échantillonnage. Pour s’assurer qu’il n’y a pas d’expériences de carambolage, il est possible de mesurer la durée de vie de la fluorescence du donneur à un flux de photons différent. Si la durée de vie augmente pendant que le flux diminue, un effet de carambolage modifie les mesures. Le flux optimal de photon est atteint avec la stabilité de vie du donateur.
En ce qui concerne l’analyse de la courbe de désintégration sFLIM, nous recommandons de s’appuyer sur chaque courbe individuelle pour s’assurer que le modèle décrit avec précision les mesures. Si ce n’est pas le cas, assurez-vous d’abord qu’aucun des artefacts mentionnés précédemment n’a corrompu les données. Ensuite, l’étape 2.1.4 fournit la fonction de réponse instrumentale (IRF) du système. Si IRF présente quelques anomalies, optimisez le chemin optique pour les minimiser. Un IRF mesuré pour l’ajustement pendant l’étape 6.2 peut également être utilisé. Enfin, les degrés de liberté du modèle d’ajustement peuvent être augmentés à une décomposition de trois exponentielles dans l’étape 6.2. Cependant, le nombre de photons requis pour la détermination de la vie et de la proportion est élevé et il est donc recommandé de ne les utiliser que pour atteindre une durée de vie moyenne plus stable à partir de l’étape 6.4. Des informations plus exhaustives sur la FLIM, sa caractérisation18, sFLIM et son application12 notamment à la lignine10, peuvent être trouvées dans la littérature.
Bien que difficile, la mesure fret dans les tissus végétaux à l’aide de l’autofluorescence indigène montre certains avantages. Par rapport aux mesures FRET effectuées sur des tissus vivants dans lesquels les études d’interaction entre les biomolécules nécessitent souvent le génie génétique pour exprimer des marqueurs fluorescents intrinsèques, tissus végétaux lignifiés comme ceux présentés ici, offrent naturel l’autofluorescence et les sondes fluorescentes extrinsèques peuvent être facilement ajoutées, ce qui permet d’économiser beaucoup de temps. Cependant, selon les espèces végétales analysées et sur d’éventuels pré-traitements effectués, l’autofluorescence est susceptible d’être modifiée, de sorte qu’elle doit être soigneusement caractérisée et le fluorophore utilisé comme sonde pourrait devoir être adapté.
La méthode sFLIM doit être appliquée aux sondes fluorescentes dépourvues d’activité catalytique (PEG et dextran). Dans le cadre de l’hydrolyse de lignocellulose végétale, des interactions des enzymes dans divers échantillons de biomasse pourraient être exécutées, ayant probablement pour résultat la détermination de l’impact de la localisation (cellules et tissus) sur la force d’interaction. La prochaine étape d’optimisation sera l’automatisation de l’étape d’analyse. En effet, avec suffisamment de données analysées, une procédure d’analyse basée sur l’apprentissage automatique pourrait être déployée pour l’analyse automatisée du phénotype, ce qui augmenterait son agrément au dépistage rapide de l’efficacité de l’enzyme-biomasse. En outre, sFLIM ne nécessite pas la fixation de l’échantillon et peut être facilement appliqué à des études dynamiques d’interaction enzyme-lignine. Une telle méthode unique est susceptible de guider la stratégie d’ingénierie des enzymes et le prétraitement de la biomasse afin d’optimiser la valorisation de la lignocellulose.
The authors have nothing to disclose.
Fanny Laurent (FARE) est chaleureusement remerciée pour la préparation des chiffres. La Fédération de Recherche FRABio (Université de Lille, CNRS) est reconnue pour fournir l’environnement technique propice à la réalisation de ce travail. Le financement a été obtenu auprès de l’Agence nationale de la recherche Français (projet LIGNOPROG ANR-14-CE05-0026).
Confocal microscope | ZEISS | LSM 710 NLO | for confocal imaging |
fine brush | to collect sections | ||
glass vials | for incubations | ||
high precision microscope cover glasses 170+/-5µm n°1,5# | Marienfeld | 0107032 | saled by Dutscher s.a in France |
Infra-red pulsed laser | COHERENT | CHAMELEON VISION | For sample excitation |
Micropipette Research Plus monocanal 20-200µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Micropipette Research Plus monocanal 2-20µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end | Thermo Fisher Scientific | LR45D | |
microtome blades disposable (pack of 50) | Agar Scientific | T5024 | saled by Oxford Instruments in France |
mPEG-Rhodamine, 10 kDa | Creative Peg Works | PSB-2263 | |
mPEG-Rhodamine, 20 kDa | Creative Peg Works | PSB-22642 | |
mPEG-Rhodamine, 5 kDa | Creative Peg Works | PSB-2264 | |
nail polish | for mounting | ||
pH meter five easy plus | Mettler toledo | FEP20 | with electrode |
poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450 | Merck (sigma-Aldrich) | P5402-1kg | for sample embedding |
razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100 | Agar Scientific | T586 | for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France |
rotary microtome | Microm Microtech | HM 360 | |
sFLim detector | BECKER-HICKL | SPC 150 | for lifetime acquisition |
sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 71500 | for buffer solution |
sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 30435-1kg | for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg |
tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da | Merck (sigma-Aldrich) | R8881-100mg |