Dieses Protokoll beschreibt ein originelles Setup, bei dem Spektral- und Fluoreszenzlebensdauermessungen kombiniert werden, um die Förster-Resonanzenergieübertragung (FRET) zwischen rhodeminbasierten Fluoreszenzsonden und Ligninpolymer direkt in dicken Pflanzenabschnitten zu bewerten.
In lignozellulosehaltiger Biomasse (LB) wird die Aktivität von Enzymen durch das Auftreten unspezifischer Wechselwirkungen mit Lignin während des Hydrolyseprozesses eingeschränkt, der Enzyme weit von ihrem Substrat entfernt hält. Die Charakterisierung dieser komplexen Wechselwirkungen ist daher eine Herausforderung bei komplexen Substraten wie LB. Die Methode misst hier molekulare Wechselwirkungen zwischen fluorophor-markierten Molekülen und nativem autofluoreszierendem Lignin, das durch Förster Resonanzenergietransfer (FRET) aufgedeckt wird. Im Gegensatz zu FRET-Messungen in lebenden Zellen mit zwei exogenen Fluorophoren sind FRET-Messungen in Pflanzen mit Lignin aufgrund ihrer komplexen Autofluoreszenz nicht trivial. Wir haben eine ursprüngliche Akquisitions- und Analysepipeline mit korrelierter Beobachtung von zwei sich ergänzenden Eigenschaften der Fluoreszenz entwickelt: Fluoreszenzemission und Lebensdauer. sFLIM (spektrale und fluoreszierende Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie) liefert die Quantifizierung dieser Wechselwirkungen mit hoher Empfindlichkeit und zeigt unterschiedliche Wechselwirkungsniveaus zwischen Biomolekülen und Lignin auf.
Die Hydrolyse von Lignocellulose in monomere Zucker wie Glukose erfordert Enzyme. Ihre Aktivität ist bekanntlich durch die Etablierung unspezifischer Wechselwirkungen zwischen Enzymen und Lignin1,2eingeschränkt, wobei letzteres ein hydrophobes Polymer und ein wichtiger Bestandteil von Lignocellulose3ist. Daher ist die quantitative Messung solcher Wechselwirkungen direkt auf der zellulären Skala eine Herausforderung, die angegangen werden muss, um die enzymkatalytische Enzymaktivität und die Lignocellulose-Vorbehandlung zu optimieren4.
Die Förster-Resonanzenergieübertragung (FRET) ist eine Methode der Wahl, um die Wechselwirkung von Biomolekülen vor Ort zu untersuchen. Diese nicht strahlungsbestrahlungsige Energieübertragung kann zwischen einem Spender und einem Akzeptor fluorophor auftreten, wenn sie unterschiedliche Bedingungen erfüllen. Das Emissionsspektrum der Spender muss sich zumindest teilweise überdas Erregungsspektrum der Akzeptoren überschneiden. Die Wahl der Fluorophore ist daher für solche Experimente von entscheidender Bedeutung. Dann nimmt die Übertragungseffizienz mit der sechsten Leistung ihrer Entfernung5 ab und tritt nur auf, wenn sich beide Moleküle in unmittelbarer Nähe befinden (typischerweise im Nanometerbereich). Andere Eventualitäten können die Übertragungseffizienz wie die Dipol-Dipol-Ausrichtung verändern, werden jedoch gemildert, wenn Fluorophore flexibel sind.
FRET kann mit verschiedenen Techniken gemessen werden und detaillierte Beschreibungen finden Sie in Literatur6,7. Kurz gesagt, die wichtigsten Methoden stützen sich auf: i) sensibilisierte Emission, bei der die Variation der Akzeptor-Emissionsfluoreszenz verfolgt wird und hauptsächlich qualitative Ergebnisse liefert; ii) Akzeptanz-Photobleichung, bei der die Spenderemissionsfluoreszenz vor und nach dem Aufnahmephotobleichvorgang gemessen wird (in diesem Fall können genauere FRET-Schätzungen erreicht werden, erfordern jedoch eine starke Laserleistung, die auf feste Proben angewendet wird); und iii) Lebensdauermessung, die für den Spender in Gegenwart des Akzeptors abnimmt. Diese Methode erfordert spezifische Instrumente und ermöglicht präzise und empfindliche Wechselwirkungsmessungen zwischen Fluorophoren. Betrachtet man die FRET-Messung zwischen Fluoreszenzsonden und Lignocellulose, so besteht die Hauptschwierigkeit darin, dass Lignocellulose kein einziges gut charakterisiertes Fluorophor ist: Es hat eine starke native und spektral breite Autofluoreszenz, die hauptsächlich aus Lignin stammt und von der Biomasseart8,9abhängt.
In diesem Papier schlagen wir ein neues und originelles Verfahren vor, das an Holz-/Pflanzenproben angepasst ist. Diese sFLIM-basierte Methode öffnet den Weg für quantitative FRET-Messungen zwischen Fluoreszenzsonden und Lignin in nativen Lignocellulose-Proben.
Die Korrelation von Fluoreszenzlebensdauer- und Emissionsspektrummessungen ermöglicht die Kombination von Vorteilen beider Methoden. Tatsächlich mangelt es allein den Spektralmessungen an Sensibilität und sie bleiben qualitativ. Auf der anderen Seite ist die Fluoreszenzlebensdauer die Methode der Wahl für traditionelle quantitative FRET-Messungen, aber es wurde gezeigt, dass die Lignin-Autofluoreszenz je nach Ligninzusammensetzung und Umgebung variieren kann16. Daher können Lignin-Wechselwirkungen mit einem Akzeptor oder Lignin-Strukturveränderungen nicht diskriminiert werden, da beide zu einer lebenslangen Abnahme führen. Wie gezeigt, ermöglicht die entwickelte Methode eine eindeutige, empfindliche und quantitative Messung von Wechselwirkungen zwischen Lignin und Akzeptormolekülen in Pflanzenabschnitten. Auch wenn die verschiedenen Schritte der Methode rigoros optimiert wurden, ist insbesondere bei den folgenden Punkten Vorsicht geboten.
In Bezug auf die Proben ist die Qualität des Pflanzenteils entscheidend, um eine fokussische Bildgebung zu gewährleisten. Die verschiedenen Schritte für die PEG-Einbettung sollten strikt befolgt werden. Der letzte Waschschritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass keine Interferenzen von PEG in den Proben verbleiben. Darüber hinaus sollten Pufferkonzentration und pH-Wert für alle Messungen streng identisch gehalten werden, da jede Änderung einen starken Einfluss auf die Fluoreszenzeigenschaften haben kann.
Die Lebensdauermessung kann auch empfindlich sein. Die Fluoreszenzlebensdauer des Spenders kann instabil sein, z. B. aufgrund einer hohen Anregung. In einem solchen Fall kann das Tuning der Laserleistung und des Zooms das Problem beheben. Eine weitere bekannte Quelle von Artefakten in TCSPC-Messungen ist photonenpulse pile-up. Tatsächlich kann TCSPC die Geschwindigkeit von zwei Photonen, die zwischen denselben beiden Laserpulsen emittiert werden, nicht messen. Während Pflanzenproben stark strukturiert sind, ist die Fluoreszenz nicht homogen und kann zu einem versteckten Puls-Pfup-Effekt führen. Während die Anzahl der Photonen pro Sekunde unter der Anregungsgrenze von 1% bleibt, kann sie in einigen Probenbereichen höher sein. Um keine Anhäufungsexperimente zu gewährleisten, kann die Messung der Spenderfluoreszenzlebensdauer bei einem anderen Photonenfluss in Betracht gezogen werden. Wenn die Lebensdauer steigt, während der Fluss abnimmt, ändert ein Anhäufungseffekt die Messungen. Der optimale Photonenfluss wird mit der Lebensdauer stabilität des Spenders erreicht.
In Bezug auf die sFLIM-Zerfallskurvenanalyse empfehlen wir, sich auf jede einzelne Kurvenanpassung zu verlassen, um sicherzustellen, dass das Modell die Messungen genau beschreibt. Wenn dies nicht der Fall ist, stellen Sie zunächst sicher, dass keines der zuvor genannten Artefakte die Daten beschädigt hat. Anschließend stellt Schritt 2.1.4 die Instrumentionfunktion (IRF) des Systems bereit. Wenn IRF einige Anomalien enthält, optimieren Sie den optischen Pfad, um sie zu minimieren. Ein gemessener IRF für die Montage in Schritt 6.2 kann ebenfalls verwendet werden. Schließlich können die Freiheitsgrade des passenden Modells in Schritt 6.2 auf einen dreiexponentiellen Zerfall erhöht werden. Die Anzahl der Photonen, die für die individuelle Lebensdauer und Proportionsbestimmung benötigt werden, ist jedoch hoch und es wird daher empfohlen, sie nur zu verwenden, um eine stabilere mittlere Lebensdauer ab Schritt 6.4 zu erreichen. Ausführlichere Informationen über FLIM, seine Charakterisierung18, sFLIM und seine Anwendung12 insbesondere auf Lignin10, finden Sie in der Literatur.
Obwohl die FRET-Messung in Pflanzengeweben mit nativer Autofluoreszenz anspruchsvoll ist, zeigt sich einige Vorteile. Im Vergleich zu FRET-Messungen an lebenden Geweben, bei denen Interaktionsstudien zwischen Biomolekülen häufig von der Gentechnik verlangt, um intrinsische Fluoreszenzmarker, lignifiziertes Pflanzengewebe, wie hier vorgestellt, auszudrücken, Autofluoreszenz und extrinsische Partner-Fluoreszenzsonden können leicht hinzugefügt werden, was viel Zeit spart. Abhängig von den analysierten Pflanzenarten und möglichen Vorbehandlungen ist es jedoch wahrscheinlich, dass die Autofluoreszenz modifiziert wird, so dass sie sorgfältig charakterisiert und Fluorophor als Sonden verwendet werden muss.
Die sFLIM-Methode muss auf fluoreszierende Sonden ohne katalytische Aktivität (PEG und Dextran) angewendet werden. Im Rahmen der pflanzenlignozellulosezellulosehydrolyse könnten Wechselwirkungen von Enzymen in verschiedenen Biomasseproben durchgeführt werden, was möglicherweise zur Bestimmung der Auswirkungen der Lokalisation (Zellen und Gewebe) auf die Wechselwirkungsstärke führen könnte. Der nächste Optimierungsschritt ist die Automatisierung des Analyseschritts. Tatsächlich könnte mit genügend analysierten Daten ein maschinelles Lernverfahren für die automatisierte Phänotypanalyse eingesetzt werden, das seine Amenability für ein schnelles Enzym-Biomasse-Effizienzscreening erhöhen würde. Darüber hinaus erfordert sFLIM keine Fixierung der Probe und kann leicht auf dynamische Enzym-Lignin-Interaktionsstudien angewendet werden. Eine solche einzigartige Methode ist wahrscheinlich, um Enzym-Engineering-Strategie und Biomasse-Vorbehandlung zu leiten, um lignocellulose Valorisierung zu optimieren.
The authors have nothing to disclose.
Fanny Laurent (FARE) wird herzlich für die Vorbereitung der Figuren gedankt. Die Forschungsföderation FRABio (Universität Lille, CNRS) ist dafür anerkannt, dass sie das technische Umfeld bietet, das der Erreichung dieser Arbeiten förderlich ist. Die Finanzierung wurde von der französischen Nationalen Forschungsagentur (LIGNOPROG-Projekt ANR-14-CE05-0026) erhalten.
Confocal microscope | ZEISS | LSM 710 NLO | for confocal imaging |
fine brush | to collect sections | ||
glass vials | for incubations | ||
high precision microscope cover glasses 170+/-5µm n°1,5# | Marienfeld | 0107032 | saled by Dutscher s.a in France |
Infra-red pulsed laser | COHERENT | CHAMELEON VISION | For sample excitation |
Micropipette Research Plus monocanal 20-200µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Micropipette Research Plus monocanal 2-20µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end | Thermo Fisher Scientific | LR45D | |
microtome blades disposable (pack of 50) | Agar Scientific | T5024 | saled by Oxford Instruments in France |
mPEG-Rhodamine, 10 kDa | Creative Peg Works | PSB-2263 | |
mPEG-Rhodamine, 20 kDa | Creative Peg Works | PSB-22642 | |
mPEG-Rhodamine, 5 kDa | Creative Peg Works | PSB-2264 | |
nail polish | for mounting | ||
pH meter five easy plus | Mettler toledo | FEP20 | with electrode |
poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450 | Merck (sigma-Aldrich) | P5402-1kg | for sample embedding |
razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100 | Agar Scientific | T586 | for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France |
rotary microtome | Microm Microtech | HM 360 | |
sFLim detector | BECKER-HICKL | SPC 150 | for lifetime acquisition |
sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 71500 | for buffer solution |
sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 30435-1kg | for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg |
tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da | Merck (sigma-Aldrich) | R8881-100mg |