このプロトコルは、ロダミンベースの蛍光プローブとリグニンポリマー間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)を厚い植物切片で直接評価するために、スペクトルと蛍光寿命の測定値を組み合わせたオリジナルのセットアップについて説明します。
リグノセルロース系バイオマス(LB)では、酵素の活性は、基質から遠く離れた酵素を維持する加水分解過程におけるリグニンとの非特異的相互作用の出現によって制限される。したがって、これらの複雑な相互作用の特性評価は、LBなどの複雑な基板において課題である。ここでの方法は、フルオロフォアタグ付け分子と天然自己蛍光リグニンとの間の分子相互作用を測定し、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)によって明らかにされる。2つの除近性蛍光色素を用いた生細胞におけるFRET測定とは対照的に、リグニンを用いた植物におけるFRET測定は、その複雑な自己蛍光のために些細なものではありません。蛍光の2つの相補的な特性(蛍光発光と寿命)の相関観察を伴う独自の取得および分析パイプラインを開発しました。sFLIM(スペクトルおよび蛍光生涯イメージング顕微鏡)は、これらの相互作用を高感度で定量化し、生体分子とリグニンの間の異なる相互作用レベルを明らかにする。
リグノセルロースをグルコースなどの単量体糖に加水分解するには酵素が必要です。それらの活性は、酵素とリグニン1、2との間の非特異的相互作用の確立によって抑制されることが知られており、後者は疎水性ポリマーであり、リグノセルロース3の主要な構成成分である。従って、このような相互作用を細胞スケールで直接定量的に測定することは、酵素触媒活性およびリグノセルロース前処理4を最適化するために対処しなければならない課題である。
フェルスター(または蛍光)共鳴エネルギー移動(FRET)測定は、生体分子相互作用をその場所でアススする方法である。この非放射エネルギー移動は、ドナーとアクエクターフルオロフォアの間で異なる条件を満たす場合に起こり得る。ドナー放出スペクトルは、少なくとも部分的に、アクセプタ励起スペクトルと重なっていなければならない。したがって、蛍光体の選択は、このような実験のために重要です。そして、移動効率は、距離5の6乗で低下し、両方の分子が近く(通常はナノメートルの範囲)にある場合にのみ生じる。他の不測の事態は、双極子双極子配向などの伝達効率を変化させる可能性がありますが、蛍光熱管に柔軟性がある場合は軽減されます。
FRETは、異なる技術によって測定することができ、詳細な説明は文献6、7で見つけることができます。簡単に言えば、主な方法は:i)アクセプタ発光蛍光の変動に従い、主に定性的な結果を提供する感作放出に依存しています。ii)ドナー発光蛍光がアクセプタ光脱白の前後に測定されるアクセプタ光漂白(この場合、より正確なFRET推定値は達成できるが、固定サンプルに適用される強力なレーザーパワーを必要とする)。およびiii)アクセプタの存在下でドナーに対して減少する生涯測定。この方法は、特定の機器を必要とし、蛍光体間の正確で敏感な相互作用測定を可能にします。蛍光プローブとリグノセルロース間のFRET測定を考慮すると、主な難点は、リグノセルロースが単一のよく特徴付けられた蛍光色素ではないということです:それは主にリグニンに由来する強いネイティブおよびスペクトル幅の自己蛍光を有し、バイオマス種8、9に依存する。
本論文では、木材/植物試料の切片に適応した新しいオリジナルの手順を提案する。このsFLIMベースの方法は、天然のリグノセルロースサンプルにおける蛍光プローブとリグニン間の定量的FRET測定への道を開きます。
蛍光寿命と発光スペクトル測定を相関させることで、両方の方法の利点を組み合わせることができる。確かに、スペクトル測定だけでは感度が欠如し、定性的なままです。一方、蛍光寿命は従来の定量的FRET測定に選択する方法であるが、リグニンの自己蛍光はリグニン組成および環境16によって異なる可能性があることが実証された。したがって、アクセプタまたはリグニン構造変化とのリグニン相互作用は、いずれも生涯の減少をもたらすため、判別できません。実証したように、開発された方法は、植物切片におけるリグニンとアクセプタ分子間の相互作用の明確で、敏感で定量的な測定を提供する。方法の異なるステップが厳密に最適化された場合でも、以下の点については特に注意が必要です。
サンプルに関しては、植物セクションの品質は、焦点の中でのイメージングを確保するために重要です。PEG 埋め込みのさまざまな手順に厳密に従う必要があります。最終的な洗浄工程は、サンプル中に残っているPEGからの干渉を防ぐために不可欠です。さらに、任意の変化は蛍光特性に強い影響を与えることができるので、バッファー濃度とpHは、すべての測定で厳密に同一に保つ必要があります。
寿命測定も繊細です。ドナーの蛍光寿命は、例えば励起が高いために不安定になることがある。このような場合は、レーザーパワーとズームを調整すると問題を解決できます。TCSPC測定におけるアーティファクトのもう一つのよく知られた源は、フォトンパルスの積み重ねである。実際、TCSPC は、同じ 2 つのレーザー パルス間で放出される 2 つのフォトンの速度を測定できません。植物サンプルは高度に構造化されていますが、蛍光は均質ではなく、隠れたパルス積み重ね効果につながる可能性があります。1 秒あたりのフォトンの数は 1% 励起制限を下回ったままですが、一部のサンプル領域では高くなる可能性があります。積み重ね実験を行わないように、異なる光子フラックスでのドナー蛍光寿命の測定を検討することができる。フラックスが減少する間に寿命が長くなると、パイルアップ効果が測定値を変更します。最適な光子フラックスはドナーの生涯安定性と達する。
sFLIM減衰曲線解析に関しては、モデルが測定を正確に記述できるように、個々の曲線フィットに依存することをお勧めします。そうでない場合は、まず、前述のアーティファクトのいずれもデータを破損していないことを確認します。次に、ステップ 2.1.4 は、システムのインストゥルメンタル応答関数 (IRF) を提供します。IRF に異常がある場合は、光パスを最適化して最小化します。ステップ6.2の間に合う測定されたIRFはまた使用することができる。最後に、継手モデルの自由度をステップ 6.2 で 3 指数減衰に増やすことができます。ただし、個々の寿命と比率の決定に必要なフォトンの数は多いため、手順 6.4 からより安定した平均寿命を達成するためにのみ使用することをお勧めします。FLIMに関するより網羅的な情報は、その特徴付け18、sFLIM及びその適用12、特にリグニン10に対して、文献に記載されている。
困難ですが、ネイティブ自己蛍光を用いた植物組織におけるFRET測定はいくつかの利点を示しています。生体分子間の相互作用研究がしばしば本質的な蛍光マーカーを発現するために遺伝子工学を必要とする生体組織に対して行われるFRET測定と比較して、ここで提示されるものとして、組織化された植物組織は、自然を提供する自己蛍光、および外因性パートナーの蛍光プローブを簡単に追加できるため、時間を大幅に節約できます。しかし、分析された植物種や可能な前処理に応じて、自己蛍光が改変される可能性が高いので、プローブとして使用する蛍光を注意深く特徴付け、蛍光色素を適応させる必要がある場合があります。
sFLIM法は、触媒活性を欠く蛍光プローブ(PEGおよびデキストラン)に適用されなければならない。植物リグノセルロース加水分解のフレームでは、種々のバイオマス試料中の酵素の相互作用が行われ、相互作用強度に対する局在化(細胞および組織)の影響の決定をもたらす可能性がある。次の最適化ステップは、分析ステップの自動化です。実際、十分な分析データがあれば、機械学習ベースの分析手順を自動表現型分析用に展開することができ、酵素バイオマス効率の高速スクリーニングに対する制素性が向上します。さらに、sFLIMは試料の固定化を必要とせず、動的酵素-リグニン相互作用研究に容易に適用することができる。このようなユニークな方法は、リグノセルロースのバロリゼーションを最適化するために、酵素工学戦略とバイオマス前処理を導く可能性が高い。
The authors have nothing to disclose.
ファニー・ローラン(FARE)は、フィギュアの準備に温かく感謝しています。研究連盟FRABio(リール大学、CNRS)は、この作業を達成するための技術的な環境を提供するために認めされています。資金はフランス国立研究機関(LIGR-14-CE05-0026)から得られました。
Confocal microscope | ZEISS | LSM 710 NLO | for confocal imaging |
fine brush | to collect sections | ||
glass vials | for incubations | ||
high precision microscope cover glasses 170+/-5µm n°1,5# | Marienfeld | 0107032 | saled by Dutscher s.a in France |
Infra-red pulsed laser | COHERENT | CHAMELEON VISION | For sample excitation |
Micropipette Research Plus monocanal 20-200µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Micropipette Research Plus monocanal 2-20µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end | Thermo Fisher Scientific | LR45D | |
microtome blades disposable (pack of 50) | Agar Scientific | T5024 | saled by Oxford Instruments in France |
mPEG-Rhodamine, 10 kDa | Creative Peg Works | PSB-2263 | |
mPEG-Rhodamine, 20 kDa | Creative Peg Works | PSB-22642 | |
mPEG-Rhodamine, 5 kDa | Creative Peg Works | PSB-2264 | |
nail polish | for mounting | ||
pH meter five easy plus | Mettler toledo | FEP20 | with electrode |
poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450 | Merck (sigma-Aldrich) | P5402-1kg | for sample embedding |
razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100 | Agar Scientific | T586 | for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France |
rotary microtome | Microm Microtech | HM 360 | |
sFLim detector | BECKER-HICKL | SPC 150 | for lifetime acquisition |
sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 71500 | for buffer solution |
sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 30435-1kg | for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg |
tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da | Merck (sigma-Aldrich) | R8881-100mg |