Summary
在本文中，我们提出了被描述为基于高分辨率熔融分析（HRM）的基因组中靶向诱导局部病变（TILLING）的协议。该方法利用DNA双工熔化过程中的荧光变化，适用于插入/删除（Indel）和单基位（SBS）的高通量筛选。
Abstract
靶向诱导局部病变在基因组（TILLING）是一种反向遗传学的策略，用于诱导突变的高通量筛选。然而，TILLING 系统对于插入/删除 （Indel） 检测的适用性较低，传统的 TILLING 需要更复杂的步骤，如 CEL I 核酸酶消化和凝胶电泳。为了提高产量和选择效率，并使得Indels和单基级（SBS）的筛选成为可能，开发了一种新的基于高分辨率熔融（HRM）的TILLING系统。在这里，我们提出了详细的HRM-TILLING协议，并展示了其在突变筛选中的应用。该方法可以通过测量高温下双链DNA的变性来分析PCR增氧核糖核酸的突变。HRM 分析在 PCR 后直接执行，无需额外处理。此外，一种简单、安全、快速的DNA提取方法与人力资源管理-TILLING集成在一起，用于识别Indels和SBS。其简单性、鲁棒性和高通量使其在水稻和其他作物的突变扫描中具有潜在的用处。
Introduction
突变是植物功能基因组学研究和新品种育种的重要遗传资源。前向遗传学方法（即从突变选择到基因克隆或品种发育）是大约20年前使用诱导突变的主要和唯一方法。McCallum等人1日开发一种新的反向遗传学方法，即"在基因组中定位诱导局部病变"，开创了一种新的范式，并自二十年代以来已应用于大量动植物物种2。TILLING特别适用于培育技术上难以确定或昂贵的特性（例如，抗病性、矿物质含量）。
TILLING最初是为筛选由化学诱变引起的点突变（例如EMS1，3）开发的。它包括以下步骤：建立一个TILLING人口;单个植物的DNA制备和汇集;靶DNA片段的PCR扩增;通过减少PCR增生和裂解的PCR增生和裂解通过CEL I核酸酶形成异质双相的形成;和识别突变个体及其特定的分子病变3，4。但是，此方法仍然相对复杂、耗时且吞吐量低。为了使它更有效率和更高的吞吐量，已经开发了许多经过修改的 TILLING 方法，例如删除 TILLING （de-TILLING） 1、3、5、6、 7，8，9，10，11，12。
HRM曲线分析基于DNA双工熔化过程中的荧光变化，是一种简单、经济、高通量的突变筛选和基因分型方法。HRM已广泛应用于植物研究，包括基于人力资源管理的TILLING（HRM-TILLING），用于筛选EMS诱变14诱导的SBS突变。在这里，我们提出了详细的HRM-TILLING协议，用于筛选水稻中伽马（α）射线引起的突变（Indel和SBS）。
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Protocol
1. 准备工作
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β射线诱变种群的发展
- 处理约20，000个干水稻种子（含水量约14%）在 β辐照设施（例如伽马细胞）中，在100 Gy（1 Gy/min）处的137克伽马射线的japonica水稻线（例如DS552）。
注：用于治疗的种子应具有高活力（例如，发芽率 >85%）。稻谷的辐照剂量可增加到150Gy。 - 在幼苗床上发芽后，将辐照种子播种，将幼苗单独移植到稻田中，并长成M1种群。
注：直接播种M1植物稀疏也可以应用，以节省劳动力成本。使用物理或生物隔离手段，防止M1植物与其他水稻品种交叉。 - 从M1植物中批量收获M2种子，每个M1恐慌1-2个种子，形成M2种群。
注：在实践中，为了简单起见，收获M1植物的所有种子，在完全混合后，对一部分进行取样，形成M2种群。 - 在室温下将约5，000M2种子浸泡在水中，用于24（稻谷）-36（黄斑米）。然后让种子在37°C下发芽2天，在培养皿中的湿透滤纸上。
注：更多的M2种子可以发芽进行分析，以增加识别突变体的概率。 - 将发芽的种子放入带小孔的种子面板上，在由吉田等人15号改性培养溶液中水培3-4周，在玻璃屋中，具有12小时光周期[白天（30⁄2）°C和夜间（24⁄2）°C]。
- 处理约20，000个干水稻种子（含水量约14%）在 β辐照设施（例如伽马细胞）中，在100 Gy（1 Gy/min）处的137克伽马射线的japonica水稻线（例如DS552）。
- 叶组织取样：使用打孔器从每个播种的完全延伸叶中切出一个圆盘（±2 mm）。
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DNA提取溶液的制备
- 缓冲器 A：加入 2 mL 的 5 M NaOH 和 10 mL 的 20% 补间 20，使最终体积为 50 mL。在DNA提取前新鲜制备缓冲液A。
- 缓冲液 B：添加 20 mL 的 1 M Tris-HCl （pH 8.0） 和 80 μL 的 0.5 M EDTA，使最终体积为 100 mL。
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PCR 引漆
- 人力资源管理分析入门：设计使用软件（例如 PrimePremier5）放大目标序列的引体，并由商业公司合成。
注：由于人力资源管理不太适用于长片段的分析，因此，放大位应小于400 bp. 片段过高（>75%）或过低（<25%）GC 内容也不适合人力资源管理分析。 - 质量控制的引物：使用彭等人12条水稻染色体上分布的24个SSR标记。
- 人力资源管理分析入门：设计使用软件（例如 PrimePremier5）放大目标序列的引体，并由商业公司合成。
2. DNA提取
- 将 4 个叶盘放入 96 孔 PCR 板的每个孔中，添加缓冲液 A 溶液（50 mL/孔）。将盘子冷冻在-80°C冰柜中10分钟。
- 在室温下解冻板，然后在95°C孵育10分钟。
- 在每个井中加入50μL的缓冲液B，并通过涡旋很好地混合。
- 在 1，500 x g下将板离心 1 分钟。上清液已准备好用于 PCR。
3. PCR 放大
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PCR 优化
- 向每个PCR井添加以下试剂：1 μL的DNA（步骤2.4中的上清液），2x主混合物的5μL（包含2xPCR缓冲液，4 mmol/L MgCl 2，0.4 mmol/L 2'-脱氧核糖苷三磷酸盐（dNTPs），以及50U/mL Taq DNA聚合酶，0.2μLμmol/L引基，并使用无核酸酶水使最终体积高达10μL。
- 使用具有梯度功能的热阻尼，使用以下 PCR 程序确定每个目标片段的最佳退火温度：94°C 时 5 分钟，在 94°C 下运行 40 个周期，在 94°C 时运行 30 秒，在 52-62 °C 时运行 30 秒，在 72°C 下运行 30 秒，在 72°C 下运行 30 秒，在 72°C 下最终延长 8 分钟，在 16°C 下保持。
- 检查1%甘蔗凝胶上的放大器，以测定最佳退火温度。
注：最佳退火温度应能对目标片段进行特定放大，无需非特异性放大和引信二聚化。
-
用于人力资源管理分析的 PCR
注：步骤2.4中所述提取的M2幼苗的HRM兼容板和DNA用于PCR。- 在10μL的最终体积下执行PCRs，使用1μL的DNA（上清），5μL的2x主混合，0.2μL每个10μmol/L引物，1μL的10x荧光染料。在每个板包括一个野生类型 （WT） 亲子样本和一个阴性 （不含 DNA） 控制。
- 在每个井中加入一滴矿物油，以防止蒸发。
- 用胶膜和离心机在 1，000 x g下密封板 1 分钟。
- 使用优化的退火温度运行 PCR。
注：在少数情况下，荧光染料可能会影响PCR扩增，因此在PCR完成后添加染料。在这种情况下，通过PCR变性和退火将染料并入DNA链。
4. 人力资源管理扫描和突变确认
- 从板中取出粘合膜，然后将板插入 HRM 机器。
- 从文件菜单中选择"新建运行"，或按屏幕顶部的"运行"按钮。
- 指定熔体从 55°C 到 95 °C 的起始和结束温度。
注：首次运行后，可以确定特定片段的熔体温度范围;因此，可以调整熔体温度，以便随后对同一片段进行分析，以节省时间。 - 选择样品进行高分辨率熔化分析，排除类似于阴性对照的样品。
- 使熔融曲线标准化，使其具有相同的开始和结束荧光。目视确认"最低"和"最低"温度光标位于曲线的区域。
- 将μF（荧光差）水平保持在默认设置 0.05。
- 从"标准"选择列表中选择"常见"与"变体"，然后选择"普通敏感度"。
- 使用 WT 作为控件;WT 的±F值为 ±0.05 的样本被视为含有突变植物。
-
突变植物的鉴定和确认。
- 确定四种植物，其中每个突变池都制成。
- 根据Allen等人17，使用CTAB方法从每种植物中提取DNA，并作一些修改。
注：使用Allen等人17描述的CTAB方法提取DNA时不使用无DNase RNase和NaAc，因为DNA质量足以进一步扩增。使用分光光度计定量后，将DNA调整到±25纳克/μL的最终浓度。 - 使用 PCR 引出剂放大目标片段，并针对 HRM 分析进行编程。
- 通过安格对扩张器的测序确定特定的分子病变。
注：一旦PCR扩增完成，将扩增剂发送到一家公司进行桑格测序。通过比较M2植物和WT之间的序列，可以识别分子病变。
5. 使用分子标记的选定突变体的质量控制
- 在10μL的最终体积下对24个SSR标记物执行PCR，使用25 ng的基因组DNA（使用CTAB协议提取），5μL的2倍主混合物，10μM SSR底漆各0.2μL。
- 使用以下程序运行 PCR：在 94°C 下运行 PCR 5 分钟，在 94°C 下运行 30 个周期，在 55°C 运行 30 秒，在 72°C 运行 30 秒，在 72°C 下进行最终扩展 7 分钟。
- 分离8%聚丙烯酰胺凝胶上的扩增剂，并通过银染色18揭示放大片段的多态性。
- 比较所选变体和 WT 的 SSR 单体型。
注：诱导突变体通常具有与其WT相同的SSR单体型，如果一个变种和WT之间有多个SSR标记不同，则变异很可能为遗传污染物（例如，混合物或交叉植物），而不是诱导突变18.
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Representative Results
人力资源管理扫描与分析
总共从4，560 M2幼苗中合成了1，140个DNA样本，并进行PCR扩增。OsLCT1和SPDT分别放大了两个大小分别为195 bp和259 bp的碎片（表2）。大多数样品的熔融曲线与 WT（μF < 0.05）没有显著差异。与 WT 显著不同的 HRM 曲线（#F > 0.05）按软件与 WT 不同的颜色分组（图 1）。
突变确认和频率
单个幼苗的DNA样本用于扩增，并测序了各自的片段。基因的突变类型和位置可以通过测序色谱图得到确认（图2）。从4，560M2幼苗中确定了三个突变，包括两个Indels和1个SBS（表2）。结果发现，所有三个突变部分在突变位点处都是杂音（图2）。
此处称为突变频率的突变频率发生在一个TILLING种群的基因组中。根据下面的公式，发现突变频率约为1/690 kb。
图1：OsLCT1（A、B）或SPDT（C）基因突变的M2幼苗的HRM-ININING。 选择野生型作为荧光差曲线发展的参考。突变体在90.0-92.0°C和81.5-83.5°C的温度下，其HRM曲线显著不同，μF s > 0.05。 这个数字已由李等人19日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：对突变体靶向片段的色谱图进行测序。矩形框表示在OsLCT1 （A ） 4304 bp 时具有 G_A 突变的杂物位;OsLCT1 4240 bp处的单个核苷酸A插入用箭头（B） 表示;和TTC三核苷酸删除位置5948-5950 bp的SPDT用黑线（C） 指示。这个数字已由李等人19日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
| 缩写 | 全名 | 优点或适用性 | 缺点 | 参考 |
| 传统耕作 | 靶向基因组中诱导的局部病变 | 用于筛选点突变 | 时间和成本消耗 | 麦卡勒姆等人，2000年;蒂尔等人，2003年 |
| 生态耕作 | 生态型-耕作 | 用于筛选自然种群的突变 | 成本高且灵敏度低 | 科马伊等人，2004年 |
| 去丁 | 删除耕作 | 用于大删除筛选 | 强烈依赖于良好的PCR系统 | 罗杰斯等人，2009年 |
| 伊蒂林 | 个性化耕作 | 使用个性化的 TIILLING 种群识别突变 | 非常住人口 | 布什和克里桑，2010 |
| DHPLC-耕作 | 变性高性能液体色谱法基于TILLING | 节省时间 | 低吞吐量 | 科拉松诺等人，2016 |
| 塞克-蒂林 | 按排序进行操作 | 高通量、非酶系统 | 相对昂贵和较高的误报 | 蔡等人，2011年;Kumar 等人，2017 |
| 人力资源管理-蒂林 | 高分辨率熔融- | 高吞吐量和节省时间;非酶系统 | PCR 片段长度的限制 | 董等人，2009年;Gady等人，2009年 |
表1：各种TILLING方法的优缺点。
| 基因名称 | 吉恩·洛基 | 基因功能 | 底漆序列 （5'-3'） | 优化后 TM （°C） | 产品尺寸（bp） | 突变数（突变类型） | ||
| OsLCT1 | LOC_Os06g38120 | 低镉运输机 | LCT-F： CTCGATAGATGCTCC LCT-R： AGAGTAGGACGGCTAC | 61 | 195 | 2 （G-A 过渡，1 bp 插入） | ||
| SPDT | LOC_Os06g05160 | 类似硫化磷的分配运输机 | SPDT-F： TTCTCGGGGTTT-R：协商一切委员会 | 52 | 259 | 1 （3-bp 删除） | ||
表2：两个目标基因、PCR扩增和突变识别的信息。
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Discussion
TILLING已被证明是一个强大的反向遗传工具，用于识别基因功能分析和作物育种的诱导突变。对于一些不易观察或确定的特征，使用高通量PCR突变检测的TILLING是获得不同基因突变体的有用方法。在番茄12、小麦11和葡萄藤20的EMS诱变种群中，已采用HRM-TILLING方法进行突变筛选。本文演示了一种更简单、更强大的人力资源管理-TILLING，适用于Indel和SBS突变筛选。
为了提高效率，使用SSF方法而不是常规的CTAB方法提取DNA，这种方法既费时又费力，需要有毒化学剂。Si等人21比较了使用SSF和CTAB方法提取的DNA的质量。虽然发现SSF提取的DNA纯度低于CTAB提取的纯度，但能满足PCR和水稻HRM分析的要求。然而，应该指出的是，从SSF提取的DNA不能长期存储，因此不适合建立一个永久的突变库。
在先前的研究中，通过HRM分析，在EMS和伽马诱变种群中，1/8突变DNA的聚集样本可以从野生型中区分。考虑到M2植物可能是诱导突变的杂合物，建议用HRM-TILLING将4种M2植物汇集用于检测突变。
为了获得更多的突变体，发展具有高突变频率的诱变种群也是至关重要的。伽马射线对M1植物的生长有显著影响。据报道，剂量较高的治疗导致叶绿素缺乏突变体的频率增加，在M2植物中，繁殖力、种子集和植物高度性能较差。此外，众所周知，不同物种对诱变的耐受性各不相同。因此，在M1植物中产生约50%杀伤力（LD50）的剂量被认为是最佳辐照剂量。然而，Li等人发现不同的突变剂量（165，246和389Gy）通过重新测序导致整个基因组中的相似突变率，这意味着低剂量可以应用于产生突变22。
本文以伽马诱导植物突变筛选的人力资源管理-TILLING为例。本文中描述的HRM-TILLING也应适用于EMS诱变种群的突变筛查。
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Disclosures
提交人声明他们之间没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家重点研究发展计划（2016YFD0102103）和国家自然科学基金（第31701394号）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
References
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