Summary
I denne artikkelen presenterer vi protokollen som er beskrevet som høy oppløsning smelte analyse (HRM)-basert Target indusert lokale lesjoner i genomer (TILLING). Denne metoden utnytter fluorescens endringer under smelting av DNA dupleks og er egnet for høy gjennomstrømming screening av både innsetting/sletting (Indel) og enkelt base substition (SBS).
Abstract
Target indusert lokale lesjoner i genomer (TILLING) er en strategi for omvendt genetikk for høy gjennomstrømming screening av indusert mutasjoner. Imidlertid, det TILLING system har færre anvendelighet for innsettingen/overstrekingen (Indel) oppdagelsen og tradisjonell TILLING nødvendig flere innviklet skritt, like CEL jeg nuklease oversikten og gel elektroforese. For å forbedre gjennomstrømningen og valg effektivitet, og for å gjøre screening av både indeler og enkelt base substitions (SBSs) mulig, utvikles et nytt høyoppløselig smelte (HRM)-basert TILLING-system. Her presenterer vi en detaljert HRM-TILLING protokoll og vise sin anvendelse i mutasjon screening. Denne metoden kan analysere mutasjoner av PCR-amplicons ved å måle denaturering av dobbelt strandet DNA ved høye temperaturer. HRM-analyse er direkte utført post-PCR uten ekstra behandling. Videre er en enkel, sikker og rask (SSF) DNA utvinningsmetode integrert med HRM-TILLING for å identifisere både indeler og SBSs. Dens enkelhet, robusthet og høy gjennomstrømning gjør det potensielt nyttig for mutasjon skanning i ris og andre avlinger.
Introduction
Mutanter er viktige genetiske ressurser for anlegget funksjonell Genomics forskning og oppdrett av nye varianter. En frem genetikk tilnærming (dvs. fra mutant utvalg til gen kloning eller variasjon utvikling) pleide å være den viktigste og eneste metoden for bruk av indusert mutasjoner ca 20 år siden. Utviklingen av en roman omvendt genetikk metode, TILLING (målretting indusert lokale lesjoner i genomer) av McCallum et al.1 åpnet et nytt paradigme, og det har siden blitt brukt i et stort antall dyr og plantearter2. TILLING er spesielt nyttig for avl trekk som er teknisk vanskelig eller kostbart å bli bestemt (f. eks, sykdomsresistens, mineral innhold).
TILLING ble opprinnelig utviklet for screening punkt mutasjoner indusert av kjemiske mutagener (f. eks, EMS1,3). Det inkluderer følgende trinn: etablering av en TILLING befolkning (s); DNA forberedelse og pooling av individuelle planter; PCR forsterkning av mål DNA-fragment; heteroduplexes formasjon ved denaturering og annealing av PCR-amplicons og kløft av CEL I nuklease; og identifisering av mutant individer og deres spesifikke molekylære lesjoner3,4. Denne metoden er imidlertid fortsatt relativt komplisert, tidkrevende og lav gjennomstrømming. For å gjøre den mer effektiv og med høyere gjennomstrømming, har mange modifiserte TILLING metoder blitt utviklet, slik som sletting TILLING (de-TILLING) (tabell 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
HRM kurve analyse, som er basert på fluorescens endringer i løpet av smelting av DNA dupleks, er en enkel, kostnadseffektiv, og høy gjennomstrømming metode for mutasjon screening og genotyperingteknologi13. HRM har allerede vært mye brukt i anlegget forskning inkludert HRM basert TILLING (HRM-TILLING) for screening SBS mutasjoner indusert av EMS mutagenese14. Her presenterte vi detaljerte HRM-TILLING protokoller for screening av mutasjoner (både Indel og SBS) indusert av gamma (γ) stråler i ris.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelser
-
Utvikling av γ-stråler mutagenized populasjoner
- Unn om 20 000 tørket ris frø (med fuktinnhold på ca. 14%) av en japonica ris linje (f. eks DS552) med 137cs gamma rays på 100 gy (1 gy/min) i en γ bestråling anlegg (f. eks gamma celle).
Merk: frø som brukes til behandling bør ha en høy levedyktighet (for eksempel med en spire rate > 85%). Den bestråling dose for Indica ris kan økes til 150 gy. - Sår bestrålt frø etter å spire på en frøplante seng og transplantasjon frøplanter individuelt til en Paddy feltet og vokse inn i M1 befolkning.
Merk: direkte seeding på M1 planter sparsomt kan også brukes til å spare lønnskostnader. Forhindre utavl av M1 planter med andre ris varianter bruker fysisk eller biologisk isolasjon betyr. - Bulk-Harvest M2 frø fra m1 planter, med 1-2 frø fra hver m1 Panic, for å danne en M2 innbyggere.
Merk: i praksis og for enkelhet, høste alle frø av M1 planter og etter fullt miksing, en del er samplet for å danne en M2 befolkning. - Sug ca 5 000 M2 frø i vann for 24 (Indica Rice)-36 (japonica ris) h ved romtemperatur. Så la frøene til å spire ved 37 ° c for 2 dager på fuktig filter papir i Petri retter.
Merk: mer M2 frø kan være spirer for analyse for å øke sannsynligheten for å identifisere mutanter. - Plasser spirer frø til seeding paneler med små hull og dyrke dem hydroponically for 3-4 uker i en kultur løsning endret fra Yoshida et al.15 i en glasshouse med en 12 h photoperiod [dagtid (30 ± 2) ° c og natt (24 ± 2) ° c].
- Unn om 20 000 tørket ris frø (med fuktinnhold på ca. 14%) av en japonica ris linje (f. eks DS552) med 137cs gamma rays på 100 gy (1 gy/min) i en γ bestråling anlegg (f. eks gamma celle).
- Prøvetaking av blad vev: Skjær en disk (Φ ~ 2 mm) fra den fullt utvidet blad av hver seeding i samme posisjon ved hjelp av et hull puncher.
-
Utarbeidelse av DNA-utvinning løsninger
- Buffer A: Tilsett 2 mL 5 M NaOH og 10 mL 20% mellom 20 for å lage det endelige volumet på 50 mL. Frisk forberede buffer A før DNA-ekstraksjon.
- Buffer B: tilsett 20 mL av 1 M Tris-HCl (pH 8,0) og 80 μL av 0,5 M EDTA for å lage et endelig volum på 100 mL.
-
PCR-primere
- Grunning for HRM analyse: design primere for forsterkning av målet sekvensen ved hjelp av programvare (f. eks primer Premier5) og syntetisere av et kommersielt selskap.
Merk: fordi HRM er mindre relevant for analyse av lange fragmenter, og dermed bør amplicons være mindre enn 400 BP. fragmenter med for høy (> 75%) eller for lav (< 25%) GC-innhold er heller ikke bra for HRM analyse. - Grunning for kvalitetskontroll: Bruk de 24 SSR markørene fordelt på de 12 ris kromosomer fra Peng et al.16.
- Grunning for HRM analyse: design primere for forsterkning av målet sekvensen ved hjelp av programvare (f. eks primer Premier5) og syntetisere av et kommersielt selskap.
2. DNA-ekstraksjon
- Plasser 4 blad plater i hver brønn på en PCR-96 brønn, Legg til buffer en løsning (50 mL/brønn). Frys platen i en-80 ° c fryser i 10 min.
- Defreeze platen ved romtemperatur, og deretter ruge ved 95 ° c i 10 min.
- Tilsett 50 μL av buffer B til hver brønn og bland godt med virvlingen.
- Sentrifuger platen i 1 min ved 1 500 x g. Supernatanten er klar for PCR.
3. PCR forsterkning
-
PCR-optimalisering
- Legg til følgende reagenser i hver PCR-brønn: 1 μL av DNA (supernatanten i trinn 2,4), 5 μL av 2x Master mix (inneholder 2x PCR-buffer, 4 mmol/L MgCl2, 0,4 mmol/l 2 '-deoxyribonucleoside Triphosphates (dNTPs) og 50 U/ml Taq DNA-polymerase, 0,2 μL hver av 10 mikromol/L-primere, og lag et endelig volum på opptil 10 μL ved hjelp av nuklease fritt vann.
- Bruk en termisk blokk med gradert kapasitet til å fastslå den optimale annealing temperaturen for hvert mål fragment ved å bruke følgende PCR-program: 5 min ved 94 ° c, etterfulgt av 40 sykluser på 30 s ved 94 ° c, 30 s ved 52-62 ° c (graderings temperatur) og 30 s ved 72 ° c , med en siste utvidelse ved 72 ° c i 8 min og et tak ved 16 ° c.
- Undersøk amplicons på 1% agarose gels for bestemmelse av den optimale annealing temperatur.
Merk: en optimal annealing temperatur bør muliggjøre spesifikk forsterkning av mål fragmentet, uten spesifikk forsterkning og primer dimerization.
-
PCR for HRM-analyse
Merk: HRM kompatible plater og DNA av M2 frøplanter utvunnet som beskrevet i trinn 2,4 brukes for PCR.- Utfør PCRene i et endelig volum på 10 μL, med 1 μL DNA (supernatanten), 5 μL av 2x Master mix, 0,2 μL hver av 10 mikromol/L-primere og 1 μL av 10x fluorescens fargestoff. I hver plate inkluderer en vill type (WT) overordnet prøve og en negativ (uten DNA) kontroll.
- Legg en dråpe mineralolje til hver brønn for å hindre fordampning.
- Forsegle platen med selvklebende film og sentrifuger ved 1 000 x g i 1 min.
- Kjør PCR ved hjelp av den optimaliserte annealing temperaturen.
Merk: i noen få tilfeller kan fluorescens fargestoff påvirke PCR forsterkning, derav fargestoffet er lagt til etter ferdigstillelse av PCR. I slike tilfeller er fargestoffet innlemmet i DNA-tråder av post-PCR denaturering og annealing.
4. HRM skanning og mutasjon bekreftelse
- Fjern lim filmen fra platen og sett inn platen i en HRM-maskin.
- Velg ny Kjør fra fil menyen eller trykk på Run -knappen øverst på skjermen.
- Angi start-og slutt temperaturene for smelte fra 55 ° c til 95 ° c.
Merk: etter første kjøring kan rekkevidden av Smeltetemperatur bestemmes for et bestemt fragment; Dermed kan Smeltetemperaturen justeres for påfølgende analyse av samme fragment for å spare tid. - Velg prøver for smelte analyse med høy oppløsning, Utelat prøver som ligner på den negative kontrollen.
- Normalisere de smeltende kurvene for å ha samme begynnelse og slutt fluorescens. Kontroller visuelt at temperatur markørene for nedre min. og lavere maks er i en region av kurvene.
- Hold ∆ F (forskjell fra fluorescens) nivå ved standardinnstillingen på 0,05.
- Velg felles kontra variant fra listen over standarder og velg Normal følsomhet.
- Bruk WT som kontroll; prøver med en ∆ F -verdi på ≥ 0,05 fra WT anses å inneholde mutant plante.
-
Identifisering og bekreftelse av mutant planter.
- Identifiser de fire plantene, hvorav hvert mutant basseng ble laget.
- Pakk DNA fra hver av disse plantene ved hjelp av en CTAB metode i henhold til Allen et al.17 med noen modifikasjoner.
Merk: DNase-Free RNase og NaAc brukes ikke ved UTTREKKING av DNA ved bruk av CTAB-metoden beskrevet av Allen et al.17, ettersom DNA-kvaliteten er god nok til ytterligere PCR-forsterkning. Juster DNA til en endelig konsentrasjon på ~ 25 ng/μL etter kvantifisering ved hjelp av en spektrofotometer. - Forsterk mål fragmentet ved hjelp av PCR-primere og programmere det samme som for HRM-analyse.
- Identifiser konkrete molekylære lesjoner ved sanger sekvensering av amplicons.
Merk: Når PCR-forsterkningen er fullført, sender du amplicons til et selskap for sanger-sekvensering. Den molekylære lesjon kan identifiseres ved å sammenligne sekvensene mellom M2 -PLANTEN og WT.
5. kvalitetskontroll av utvalgte mutanter med molekylær markører
- Utfør PCR for de 24 SSR markører i et endelig volum på 10 μL med 25 ng av genomisk DNA (utvunnet ved hjelp av CTAB-protokollen), 5 μL av 2x Master mix, 0,2 μL av hver av 10 μM SSR primere.
- Kjør PCR ved hjelp av følgende program: 5 min ved 94 ° c, etterfulgt av 30 sykluser på 30 s ved 94 ° c, 30 s ved 55 ° c og 30 s ved 72 ° c, med en endelig utvidelse ved 72 ° c i 7 min.
- Skill amplicons på 8% polyakrylamid gels og avslører polymorfisme av forsterket fragmenter av sølv flekker18.
- Sammenlign SSR haplotypes av utvalgte varianter og WT.
Merk: indusert mutanter har ofte SSR haplotypes identisk med sin WT, hvis mer enn én SSR markører er forskjellig mellom en variant og WT, er varianten høy sannsynlighet for å være en genetisk forurensning (f. eks en blanding eller outcrossed plante) snarere enn en indusert mutant18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HRM skanning og analyse
Totalt ble 1 140 samlede DNA-prøver fra 4 560 M2 frøplanter produsert og utsatt for PCR forsterkning. To fragmenter med størrelsen på 195 BP og 259 BP ble forsterket for OsLCT1 og SPDT, henholdsvis (tabell 2). De fleste prøvene hadde smelte kurver som ikke var signifikant forskjellig fra WT (ΔF < 0,05). HRM-kurvene signifikant forskjellig fra WT (ΔF > 0,05) ble gruppert med farge (r) forskjellig fra WT av programvaren (figur 1).
Mutasjon bekreftelse og hyppighet
En DNA-prøve fra en individuell frøplante ble brukt til forsterkning og den respektive fragmentet var i rekkefølge. Mutasjonen type og plassering på genene kan bekreftes av sekvensering kromatogrammene (figur 2). Tre mutasjoner inkludert to indeler og en SBS ble identifisert fra 4 560 M2 frøplanter (tabell 2). Det ble funnet at alle de tre muterte delene ble heterozygot på mutasjon stedet (figur 2).
Mutasjonen frekvensen her referert til som frekvensen av mutasjon skjedde i Genova i en TILLING befolkning. Basert på formelen nedenfor, ble det funnet at mutasjon frekvensen utgjorde ca 1/690 kB.
Figur 1: HRM-TILLING på M2 frøplanter for mutasjoner i OsLCT1 (A, B) eller SPDT (C) gener. Den ville typen ble valgt som referanse for utviklingen av fluorescens forskjell kurver. Mutanter viste signifikant forskjellige HRM kurver med ΔFs > 0,05 ved temperaturer på 90.0-92.0 ° c og 81.5-83.5 ° c, henholdsvis. Dette tallet er endret fra Li et al.19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: sekvensering kromatogrammene av målrettede fragmenter av mutanter. Den rektangulære boksen indikerer en heterozygot område med en mutasjon av G → A på 4304 BP av OsLCT1 (a); én enkelt nukleotid en innsetting ved 4240 BP på OsLCT1 indikeres av en pil (B). og en TTC trinucleotide sletting ved posisjonen til 5948-5950 BP av SPDT indikeres med en svart linje (C). Dette tallet er endret fra Li et al.19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Forkortelse | Fullt navn | Fordeler eller anvendelighet | Ulemper | Referanse |
| Tradisjonell TILLING | Målretting indusert lokale lesjoner i genomer | For screening punkt mutasjoner | Tid og kostnader forbruker | McCallum et al., 2000; Till et al., 2003 |
| Øko-TILLING | Ecotype-TILLING | For screening mutasjoner i naturlige populasjoner | Kostbar og lav følsomhet | Comai et al., 2004 |
| De-TILLING | Sletting TILLING | For stor sletting screening | Avhenger sterkt på godt PCR-system | Rogers et al., 2009 |
| iTILLING | Individualisert TILLING | Identifisering av mutasjoner ved hjelp av personlig TIILLING populasjoner | Ikke permanent befolkning | Bush og Krysan, 2010 |
| DHPLC-TILLING | Denaturering høyytelses flytende kromatografi-basert TILLING | Tidsbesparende | Lav gjennomstrømming | Colasuonno et al., 2016 |
| SEQ-TILLING | TILLING etter sekvensering | Høy gjennomstrømming, ikke-enzymatisk system | Relativt kostbare og høyere falske positive | Tsai et al., 2011; Kumar et al., 2017 |
| HRM-TILLING | Smelte-TILLING med høy oppløsning | Høy gjennomstrømming og tidsbesparende; Ikke-enzymatisk system | Begrensning av PCR-fragment lengde | Dong et al., 2009; Gady et al., 2009 |
Tabell 1: fordeler og ulemper ved ulike TILLING tilnærminger.
| Gene navn | Gene Loci | Gen funksjon | Primer sekvens (5 '-3 ') | TM etter optimalisering (° c) | Produktstørrelse (BP) | Antall mutasjoner (mutasjon-type) | ||
| OsLCT1 | LOC_Os06g38120 | Lav kadmium transporter | LCT-F: CTCGATGTTAAGCATGCTCC LCT-R: AGAGTCAGGAACGCGGCTAC | 61 | 195 | 2 (G-A overgang, 1-BP innsetting) | ||
| SPDT | LOC_Os06g05160 | SULTR-lignende fosfor distribusjon transporter | SPDT-F: TTCTCGGAGGAGGCTAAT SPDT-R: CCACGCATTCTGGTTACAT | 52 | 259 | 1 (3-BP sletting) | ||
Tabell 2: informasjon om to mål gener, PCR forsterkning og mutasjoner identifisert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TILLING har vist seg å være et kraftig omvendt genetisk verktøy for å identifisere induserte mutasjoner for gen funksjonell analyse og avling avl. For noen egenskaper som ikke lett observeres eller bestemmes, kan TILLING med høy gjennomstrømming PCR-basert mutasjon-deteksjon være en nyttig metode for å få mutanter for ulike gener. HRM-TILLING metoden har blitt brukt i EMS-mutagenized bestander av tomat12, hvete11 og Grapevine20 for mutasjon screening. I denne utredningen, en enklere og kraftigere HRM-TILLING ble demonstrert, gjelder for både Indel og SBS mutasjon screening.
For å forbedre effektiviteten ble DNAs ekstrahert ved hjelp av SSF-metoden i stedet for den vanlige CTAB-metoden, som er tid-og arbeidskrevende og krever giftige kjemiske midler. Si et al.21 sammenlignet kvaliteten på DNA ekstrahert ved hjelp av SSF og CTAB metoden. Selv om det ble funnet at DNA fra SSF ekstraksjon hadde renhet dårligere enn CTAB utvinning, kan det oppfylle kravene i PCR og HRM analyse i ris. Imidlertid bør det bemerkes at DNA fra SSF utvinning ikke kunne lagres i lang tid, derfor er det ikke egnet for å etablere et permanent mutant bibliotek.
I en tidligere studie kan samlede prøver med 1/8 mutant DNA være differensiert fra vill-type ved HRM-analyse i både EMS og gamma mutagenized populasjoner14,19. Vurderer M2 planter kan være heterozygot for indusert mutasjoner, pooling av fire M2 planter ble anbefalt for å påvise MUTASJONER av HRM-TILLING.
For å få mer mutanter, er det også avgjørende å utvikle mutagenized populasjoner med høy mutasjon frekvens. Gamma stråler hadde betydelig effekt på veksten av M1 planter. Det har blitt rapportert at behandling med høyere dose resulterte i økt hyppighet av klorofyll-mangelfull mutanter og dårligere ytelse av fruktbarhet, frø sett og plante høyde i M2 planter18. Videre var det kjent at toleranse for mutagener varierte blant ulike arter. Derfor, dosen som resulterer i ca 50% dødelighet (LD50) i M1 planter ble betraktet som den optimale bestråling dose. Men, Li et al. funnet ulike mutasjon doser (165, 246 og 389 gy) resulterte i lignende mutasjon priser i hele Genova ved resequencing, som antydet en lav dose kan brukes til å generere mutasjoner22.
Dette papiret viste eksempel på HRM-TILLING for mutasjon screening av gamma indusert planter. HRM-TILLING beskrevet i denne utredningen bør også være aktuelt for screening mutasjoner i EMS-mutagenized populasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av det nasjonale nøkkel forsknings-og utviklingsprogrammet i Kina (no. 2016YFD0102103) og det nasjonale natur vitenskaps stiftelsen i Kina (no. 31701394).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
- Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
- Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
- Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G.
- Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
- Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
- Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
- Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
- Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
- Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
- Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
- Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
- Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , Manila, the Philippines. (1976).
- Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
- Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
- Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
- Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
- Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
- Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).
