Summary
Burada, erişkin farelerde intrasisternal enfeksiyon yolu ile meningokok menenjitini tetikleyen bir yöntem tanımlıyoruz. İnokül inosiyal enfeksiyona kadar meningokok enfeksiyonunun adım adım protokolünü sıyoruz; sonra hayvan hayatta kalma kaydetmek ve mindik dokularında bakteri yükleri değerlendirmek.
Abstract
Neisseria menenjiti (meningokok) bakteriyel menenjitin önde gelen nedeni olarak kabul edilen dar konaklı bir mikroorganizmadır. Meningokok, sağlıklı öznenin yaklaşık %10'unun insan nazofapolisinin geçici bir kolonisidir. Özellikle durumlarda, mukozal bariyeri aşmak için invaziv bir yetenek kazanır ve septisemi neden kan dolaşımını işgal. Son durumda, fulminating sepsis bile menenjit sonucu gelişimi olmadan ortaya çıkabilir. Tersine, bakteriler kötü kan dolaşımında çoğalmak olabilir, kan beyin bariyerini geçmek, merkezi sinir sistemine ulaşmak, fulminant menenjit yol. Bakteriyel menenjit in murine modelleri konak-patojen etkileşimlerini araştırmak ve bu ölümcül hastalıktan sorumlu patogenetik mekanizmaları analiz etmek için yararlı bir araç tır. Son yıllarda birçok deneysel model sistemi değerlendirilmiş olsa da, bunların hiçbiri meningokok hastalığının karakteristik patolojik olaylarını yeniden üretememiştir. Bu deneysel protokolde, bakterilerin intrasisternal aşılamadayalı bir fare modelimeningokok menenjit indüksiyonu için ayrıntılı bir prosedür açıklanır. İnsan menenjitinin kendine özgü belirtileri klinik parametrelerin (örn. sıcaklık, vücut ağırlığı), sağkalım oranının değerlendirilmesi, mikrobiyolojik analiz ve beyin hasarının histolojik incelemesi ile mürin konakta kaydedildi. Intrasisternal kullanırken (i.cist.) inoculum, meningokok doğrudan sarnıç magna içine teslim, beyin dokusunda çok verimli bir meningokok replikasyonu yol. Bakterilerin canlı sayısında 1.000 kat artış yaklaşık 18 saat içinde gözlenmektedir. Ayrıca, meningokokda dalalak ve enfekte farelerin karaciğerbulunur, karaciğer meningokok replikasyonu için bir hedef organ temsil edebilir düşündüren.
Introduction
Neisseria menenjitidis, dünya genelinde insan popülasyonunda menenjit ve sepsisin en yaygın nedenlerinden biri olarak bilinen, insan konakçısı ile sınırlı bir Gram negatif β-proteobacteriumdur. Bu sağlıklı ve asemptomatik taşıyıcıların üst solunum yolu (burun ve boğaz) kolonize (nüfusun% 2-30), ama bakteri bazen çeşitli konak bağışıklık savunma kaçar ve kontrolsüz bir lokal neden beyne kan dolaşımından yayılır meningokok menenjiti olarak bilinir. Konak ve bakteriyel faktörlerin bir kombinasyonu invaziv davranış1commensal geçiş katkıda bulunmak için görünür.
N. menenjitidis insan kolonizasyonu ve enfeksiyon sadece uzmanlaşmıştır. Bu dar bir konak aralığı vardır ve bu nedenle, insan meningokok hastalığı çoğaltmak uygun hayvan modelleri eksikliği nedeniyle in vivo patogenez çalışmaları sınırlıdır. Sonuç olarak, meningokokların neden olduğu septisemi ve menenjit patogenezine ilişkin anlamada temel boşluklara yol açmıştır. Son yıllarda, birçok in vitro sistemlerin geliştirilmesi birkaç meningokok virülansfaktörlerininbelirlenmesine izin 2,3,4. Bu değerli çalışmalar başarılı bir meningokok enfeksiyonu için bu faktörlerin rolünü anlamak için önemli anlayışlar sağlamış olsa da, bu modeller mizahi ve hücresel ile bakteri etkileşimlerinin sonuçlarının değerlendirilmesine izin vermedi bağışıklık sistemi ve hatta daha az tüm doku ile. In vivo hayvan enfeksiyon modelleri aşı formülasyonları tarafından verilen koruma derecesinin değerlendirilmesi için de büyük önem ehemdir. İnsan-tropik bir patojen olarak meningokoklar, yüzey yapıları (örneğin, tip IV pili ve opaklık proteinleri) ve insan reseptörleri ve taşıma proteinleri için demir alım sistemleri (yani, transferrin ve laktoferrin)5,6,7 düzgün uymak, hayatta kalmak ve insan konak işgal. Son olarak, patojengenetik varyasyon yetenekleri kaçınmak ve / veya insan bağışıklık yanıtı engellemek için daha yüksek türler tropizmkatkıda 8,9. Bu nedenle, etkileşimde yer alan belirli konak faktörlerin yokluğu, meningokok yaşam döngüsünü özetleyen küçük hayvan modellerinin gelişiminde önemli zorluklar oluşturarak, patojenin yaşam döngüsünün adımlarını engelleyebilir.
Son yıllarda meningokok enfeksiyöz döngüsünü anlamamızı geliştirmek için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. Meningokok hastalığı10,11 ,12,13,14 üremek için iki hayvan modeli, fare ve sıçan, intraperitoneal (yani) veya intranasally (i.n.) enfeksiyonları geliştirilmiştir ,15,16,17. Laboratuvar faresi muhtemelen deneysel meningokok enfeksiyonu indükleyen daha çok yönlü hayvanlardan biridir.
Ancak, i.p. enfeksiyonun yolu, doğal enfeksiyon rotasını taklit etmese de şiddetli sepsis gelişimine yol açarken, enfeksiyon yolu meningokok patogenezi değerlendirmek için yararlı olurken, akciğer enfeksiyonuna neden olsa da önce sepsis10,11,12,13,14,15,16,17.
I.p. fare modeli meningokok meydan10,11,12koruma değerlendirmek için etkili oldu. İnfeksiyonun i.n. rotasına dayalı meningokok kolonizasyonunun fare modeli, erkeklere daha yatkın oldukları için, insanlarda meningokok hastalığının seyrini taklit eden invaziv bir enfeksiyonu yeniden üretmek için bebek farelerle geliştirilmiştir. 13,14,15,16,17. Ayrıca, minür konak meningokok replikasyonunu teşvik etmek için, teknik stratejiler artan sayıda da enfeksiyon geliştirmek için hayvanlara demir yönetimi de dahil olmak üzere uygulanmıştır, yüksek bakteriyel inoculumkullanımı , fare-geçitli bakteriyel suşu yanı sıra bebek veya bağışıklık tehlikeye hayvan istihdam10,13,15,18,19. CD4620 veya transferrin21 gibi belirli insan faktörlerinin ifadesi farelerin bu insan-tropik bakteriye duyarlılığını artırmıştır; enfeksiyon insan deri ksenogreft modelinin istihdam da insan endotel22,23meningokokların adezyon yeteneğini değerlendirmek için yararlı olmuştur. İnsanlaşmış transgenik farelerin son gelişimi meningokok patogenezi ve konak etkileşimlerinin anlaşılmasını iyileştirmiştir.
Daha önce, biz bakteri aşılama fare geçitli bakteriler ile yetişkin farelerin sarnıç magna içine yapıldı meningokok menenjit bir minür modeli geliştirdi24. Enfekte farelerin klinik parametreleri ve sağkalım oranı, beyin de görülen lerin yanı sıra beynin mikrobiyolojik ve histolojik analizlerine benzer özelliklere sahip menenjitin oluşmasını göstermiştir. Bu enfekte fareler, bakteriler de, kan kurtarıldı, karaciğer, ve dalak, ve çevresel organlardan bakteriyel yükler bulaşıcı doz ile ilişkili. Özellikle, Bu model L-glutamat taşıyıcı GltT kusurlu bir iyojenik mutant suşu virülansını değerlendirmek için kullanılmıştır24. Son zamanlarda, i.cist dayalı meningokok menenjit bizim fare modeli kullanarak. serogroup C suşu ile rota 93/42862,24 ve udp-N-asetilglukozamin 2-epimerase25için cssA gen kodlama bir izojenik mutant kusurlu , biz işyerinde maruz siyalik asit rolünü analiz ettik farelerde hastalık.
Bu protokolde, i.cist'e dayalı deneysel meningokok menenjitini tetiklemek için basit bir yöntem tanımlıyoruz. Balb/c yetişkin farelerde enfeksiyon rotası. Bu yöntem özellikle bir mingokok konakmeningokok enfeksiyonunun karakterizasyonu için yararlı dır, yanı sıra yabani tip referans suşları ve izojenik mutantlar arasındaki virülans değerlendirilmesi için. Enfeksiyonun sarnıç içi güzergahı meningokokların doğrudan sarnıktan magna'ya tam olarak ulaşmasını sağlar, bu da beyin omurilik sıvısında (BOS) bakteri çoğalmasını kolaylaştırır ve menenjiti taklit eden özelliklere neden olur. insanlarda mevcut2,24,25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, 24 Kasım 1986 tarihli Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi (86/609/EEC) uyarınca hayvan acılarını en aza indirmek ve fare sayısını azaltmak için yapılmıştır. Bu çalışmada bildirilen in vivo deneyler Etik Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (Prot. sayı 2, 14 Aralık 2012) ve İtalya Sağlık Bakanlığı (Prot. numarası 0000094-A-03/01/2013) tarafından onaylanmıştır. Tüm prosedürler BSL2 odasında Ki Biyogüvenlik Kabini 2 (BSC2) içinde yapılmalı ve potansiyel enfekte atıklar özel konteynerlere atılmalıdır.
1. N. meningitidis Serogroup C Strain ile Farelerin Enfeksiyonu
DİkKAT: N. menenjititler potansiyel olarak zararlı bir patojendir ve bu mikroorganizmayı kullanırken gerekli tüm önlemler alınmalıdır. Tüm deney Biyogüvenlik Düzey 2 (BSL2) çevreleme gerektirir. Hayvan çalışmalarında yer alan araştırmacı deney süresince tek kullanımlık kişisel koruyucu ekipman (PPE) takmalıdır.
- İn vivo enfeksiyon çalışmaları için bakterilerin hazırlanması
- GC taze neisseria menenjitidis kültüründen tek bir koloni seçin (Gonococcal) agar plaka ile takviye 1% (vol / vol) Polivitoks takviyesi ve GC suyu 10 mL aşılamak.
- 220 rpm hızı ile bir orbital shaker inkübatör 37 °C'de bakterileri büyütün. Spektrofotometre ile kültürün o.D.'sini kontrol etmeye devam et. • 7 x 108 CFU/mL'ye karşılık gelen 0,7'lik optik yoğunluklu OD600nm'de erken üstel aşamaya kadar kültürü büyütün.
- Gerekli o.D. elde edildikten sonra, % 10 gliserol ekleyerek dondurulmuş stokları yapmak. Cryovials kültürün 1 mL dağıtın. Şişeleri kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
NOT: Taze bakteri kültürünü kullanmak daha iyi olsa da, dondurulmuş stoklar in vivo deneyi basitleştirmek ve standartlaştırmak için kullanılmıştır. Genellikle dondurulmuş stokları hazırlanmasından itibaren yaklaşık 6 ay içinde istihdam edilmiştir. - Enfeksiyondan önce, oda sıcaklığında dondurulmuş bakterileri eritin.
- Bakteri hücrelerini 15 dakika 1.500 x g'de santrifüj ile hasat edin ve demir dekstran (5 mg/kg) içeren taze GC suyu 1 mL'de yeniden askıya alın.
NOT: GC suyu demir dextran eklenmesi ile hazırlanır (5 mg /kg) ev sahibi dokumeningokok replikasyonu lehine14,18,27. - Kullanmadan önce, enfeksiyon için CFU tam sayısını belirlemek için bakteri uygun sayıları gerçekleştirin. Bunu yapmak için, 10 μL bakteriyel süspansiyon almak ve seri seyreltme ile devam ve GC agar plakaları üzerinde her seyreltme yayıldı ve 37 °C% 5 CO2ile kuluçka , 18-24 saat için.
- Farelerin sarnıç içi enjeksiyonu
Not:Tüm prosedür aseptik koşulları korumak için laminar akış kabininde gerçekleştirilir.- Ev laboratuvar fareleri (8 haftalık, dişi Balb/c) spesifik patojensiz koşullar altında. Gıda pelet ve su reklam libitum sağlayın.
- Deneye başlamadan önce hayvanları 1 hafta boyunca yeni çevreye yerleştirin.
- Deneye başlamadan önce vücut ısılarını tartın ve değerlendirin.
NOT: Sekiz haftalık inbred Balb / c dişi fareler yaklaşık 19 g ortalama ağırlığındadır. Laboratuvar farelerinin ortalama sıcaklığı fizyolojik olarak 36-38 °C24arasında değişmektedir. - Hayvanı boyundan scruff, karın bölgesini %70 etanol ile temizleyin ve 25 G iğne 0.5 mm x 16 mm kullanarak karın alt sağ kadrağına %1 fosfat salin tamponunda çözünmüş i.p. demir dekstran (% 1 fosfat salin tamponunda çözünmüş, 250 mg/kg) enjekte edin. , enfeksiyondan yaklaşık 2-3 saat önce.
NOT: İntraperitoneal enjeksiyon, idrar kesesi, çekum gibi karın organlarına zarar vermemek için karın alt sağ kadranda yapıldı. Eksojen demir kaynağının uygulanması, demir dextran şeklinde, hayvanlara enfeksiyon dan önce ev sahibi14,18,27bakteriyel çarpma lehine . - 2-3 saat sonra ketamin (50 mg/kg) ve ksilazin (3 mg/kg) ve oftalmik yağlayıcı ile hayvananestezisi yapın.
- Parmak sıkışma üzerine ağrı yanıtı yokluğu sağlayarak anestezi derinliği ni kontrol edin.
- Fareyi sternal dekübitusta yerleştirin ve vertebral kolonu düz bir pozisyonda tutmak için ekstremiteleri ve servikal omurgayı dikkatlice gerin.
- 30 G iğne x 8 mm'lik bir şırınga yüklemeden önce tutarlı bir süspansiyon u korumak için bakteriyel süspansiyonu yavaşça karıştırın.
NOT: Bakteriyel süspansiyonu enjeksiyon süresine mümkün olduğunca yakın hazırlayın; bu arada, oda sıcaklığında saklayın. - Post erime bakteriyel titre (CFU / mL) dayanarak, kullanılacak toplam CFU hesaplama ile devam, enfekte edilecek hayvanların toplam sayısı ile ilgili olarak (Hayvan sayısı başına CFU bakteriyel doz). Erime sonrası bakteriyel titre (CFU/mL) ile n fare enfeksiyonu için yararlı toplam CFU (erime sonrası bakteriyel titreCFU CFU) arasında bir oran uygulayarak toplam CFU elde etmek için şişeden alınacak tam hacmin hesaplanmasına devam edin : ml = toplam CFU : x). Enfekte edilecek toplam hayvan sayısına göre son hacmi belirleyin.
NOT: Bu deneylerde hayvan başına 104 ile 109 arasında geniş bir titre kullanılmıştır. - Cerrahi bölgeyi %70 Etanol ile temizleyin.
- Enjeksiyon noktasını bir iğne yardımıyla tanımlayın ve meningokokların (yabani tip zorlanma ve izojenik mutant türü) veya demir dextran (5 mg/kg) ile desteklenen GC etsuyuna toplam 10 μL'lik bir hacimle farelerin sarnıcı magna'sına enjekte edin 30 G iğne x 8 mm kullanarak oksipital çapak deliğinden geçirin.
- Sarnıç inokülü, iğneyi özellikle dorsal subaraknoid alana kraniyokervical kavşağa yerleştirerek gerçekleştirin. Ventroflex bu alanı erişilebilir hale getirmek için kafa28.
- Kısaca, hayvanı lateral recumbency yerleştirin, yol kulakları tutun ve orta boynu esnetin (90-100 °). Boyun ve başın orta çizgisinin (burundan occiputa kadar) masa nın ortasına mükemmel paralel konumda olduğundan emin olun.
- Atlas kanatlarına dokunun ve eksenel dönüşü ortadan kaldırarak çakıştınktan emin olun. Doğal bir girinti genellikle iğne oksipital deliğe girmek için en olasıdır orta hatta dokundu olabilir.
- Neisseriaile fare enjeksiyonu sonra güvenli bir şekilde şırınga ve iğne atın.
- Kafese hayvan yerleştirin ve uyanış ve hareket tam iyileşme bekleyin.
- Bir laminar akış dolabı altında enfekte fareler ile kafesler tutun.
- Monitör fareler, 24 saat sonrası enfeksiyon, koma skalasına göre koma klinik belirtileri için29. Koma ölçeği: 1 = koma, 2 = sırtdöndükten sonra dik durmaz, 3 = 30 s içinde dik durur, 4 = 5 s içinde dik durur, minimum ambulatuar faaliyetler, 5 = normal.
NOT: Hayvanlarda ağrı kaydedildiğinde meloksikam lı analjezi (çalışma süresi için 5 mg/kg i.p.) uygulandı. - Hayvan hayatta kalma veya CFU adım 2 ayrıntılı olarak enfekte hayvanlar üzerinde tsay say için devam edin.
- Servikal çıkığı ile 2 puan ve istatistiksel analiz için ölü olarak kayıt ile farelerin ötanazi gerçekleştirin.
2. Hayvan Survival ve CFU Sayıları
-
Hayvan hayatta kalma
- I.cist tarafından hayvanlara bulaşmasını sağlamak için farklı dozlarda (fare başına 104 ila 109 CFU arasında değişen) bakteriyel inocula hazırlayın. (bkz. adım 1.2).
- Aynı şekilde, demir dextran (5 mg/kg) ile desteklenen GC suyu ile inoculate kontrol fareleri.
- Klinik belirtiler için monitör hayvanlar: fırfırlı kürk, kambur görünüm, hipotermi, kilo kaybı, uyuşukluk, ya da moribund24,25,26,30, 168 saat boyunca tüm deney boyunca her gün (7 gün) deney süresince günde en az iki kez.
- Vücut ağırlığını ve sıcaklığını sırasıyla her gün dijital denge ve rektal termometre kullanarak ölçün.
- Farelerin hayatta kalmasını bir hafta kaydet.
NOT: Koman değeri 2'ye ulaşan veya 168 saatten fazla gözlemlenen hayvanlar ötenazi yeşerti. - Komaya değeri 2 olan veya ketamin (50 mg/kg) ve ksilazin (3 mg/kg) ile gözlem süresi boyunca hayatta olan fareleri anestezik ve oftalmik merhem uygulayın.
- Ağrı yanıtının parmak tutamında olup olmadığını kontrol edin.
- Servikal çıkığı ile farelerin ötanazi yapmak ve istatistiksel analiz için ölü olarak kayıt.
-
Periferik organlarda koloni oluşturan birimlerin (CFU) sayısının değerlendirilmesi
- Bir alt-öldürücü bakteriyel doz kullanın (5 x 105CFU / fareler) ist tarafından hayvanları aşılamak için hayvan sağkalım sonuçları temelinde. (bkz. alt bölüm 1.2).
- Enfeksiyon sırasında her gün rektal sıcaklığı izleyin ve adım 2'de belirtildiği gibi 48 saat sonrası enfeksiyon hayvanların anestezi yapmak.
- Göğsün %70 etanol dezenfeksiyonuna devam edin ve 25 G iğne 0.5 mm x 16 mm kullanarak göğüs boşluğunun kardiyak delinmesi ile 600-700 μL kan çekin.
- Kanı %3,8 sodyum sitrat içeren bir tüpte toplayın ve daha sonra uygulanabilir bakteri hücresi sayımları için -80 °C'de saklayın.
- Hayvanları kurban etmek için servikal çıkığı gerçekleştirin. Fareyi ilgili tüm kurumsal ve etik kurallara göre feda ettikten sonra, kalp atışı nın yokluğunu kaydeden ölümü doğrulayın.
- Fareyi supine pozisyonunda yerleştirin ve vücudun sagital düzlemi boyunca kürk kesimi ile devam etmek için makas ve forceps kullanın. İğneler ile vücudun yanlarında kürk ile cilt düzeltin.
- Keskin makas kullanarak periton zarını kesin. Organları çıkarmak için makas ve tek kullanımlık forseps kullanın (örneğin, dalak ve karaciğer) ve steril Petri çanak her biri koymak 1 mL GC suyu ile takviye 10% (vol / vol) gliserol.
- Fare gövdesini IACUC yönergelerine göre güvenli bir şekilde atın.
- Tek hücreli süspansiyon oluşana kadar yaklaşık 2-3 dakika boyunca 5 mL şırınganın pistonlu ile oda sıcaklığında organları mekanik olarak homojenize edin ve bir tüpe aktarın.
- Tüpe homojenize doku örneğini hemen kuru buzun üzerine koyun.
NOT: Numuneler -80 °C'de 2 mL steril bir tüpte saklanabilir ve daha sonraki noktalarda uygulanabilir bakteri hücresi sayımları yapılabilir. - Gerektiğinde antibiyotik ile GC agar plakaları olun. 37 °C'de kuluçkaöncesi kullanmadan önce plakaları 2-3 saat kurulayın.
- GC suyundaki numunelerin 10 kat seri seyreltmelerini her homojenize doku dan ve plakadan GC agar plakalarına hazırlayın. Bir gecede %5 CO2ile 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
3. CFU Sayısı için Beyin Dokularının Hazırlanması
- Bir alt-öldürücü bakteriyel doz kullanın (5 x 105 CFU / fareler) ist tarafından hayvanları aşılamak için hayvan sağkalım sonuçları temelinde. (bkz. alt bölüm 1.2).
- 2. adımda belirtildiği gibi, hayvanların belirlenen enfeksiyon zamanında anestezi sini yapın.
- Servikal çıkığı ile hayvanların ötanazi gerçekleştirin.
- Cerrahi bölgeyi %70 Etanol ile temizleyin.
- Büyük bir makas kullanarak fare nin başını kesin.
- Küçük cerrahi makas ve ince uçlu çelik çömleği yardımıyla kürk ve deri rezeksiyon, açıkça dikişgörmek ve kafatası nın açılması na rehberlik edebilmek için kafatasının üst doğru ilerleyen.
- Kafatası açmak için foramen magnum aracılığıyla küçük bir makas ucu nu yerleştirin.
- Kafatasının merkezine doğru ve kafatasının karşı tarafına parietal kemiğin orta çizgisini boyunca kesin. Lambdoid sütürünün lateral kenarı boyunca hafifçe kesin.
- Arka parietal köşeden başlayarak kafatası kaldırın ve ince uçlu forseps kullanarak, beyin keşfetmek için çapraz yukarı çekin.
- Kafatası kaldırıldığında beyin dokusunun başın herhangi bir kemiğine bağlı olmadığından emin olun.
- Beyin dokusukafatası ile birlikte kaldırıldı sağlamak için, kafatası ve beyin arasındaki herhangi bir bağ dokusu kaldırmak için tek kullanımlık forseps kullanın.
- Beyin dokusunun çok fazla kuruması na izin verme. Beyin yerleştirin, tek kullanımlık forseps kullanarak, GC suyu 1 mL ile bir Petri kabında 10% (vol / vol) gliserol ile desteklenmektedir.
- Beyni 5 mL şırınganın pistonlu sulandırmasıyla mekanik olarak homojenize edin (bkz. adım 2.2.9). Numuneleri 2 mL steril bir tüpe aktarın ve 2.2'de tartışılan daha sonra uygulanabilir bakteri hücresi sayımları için -80 °C'yi depolayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
N. menenjitidis yabani tip ve isojenik mutant suşları ile enfekte farelerin sağkalım.
Bu temsili sonuçlarda kullanılan Neisseria menenjitidis suşları serogroup C referans suş 93/4286 (ET-37) ve onun isojenik mutant 93/4286ΩcssA cssa insiyatifi ile elde edilen cssA geninin insiyatifini, UDP-N-asetilglukozamin 2-epimerase, kapsül sentezi locus25bu haritalar . Mevcut mürin modelinde cssA-kusurlu suş virülans derecesini değerlendirmek için, ölümcül doz enfekte hayvanların% 50 ölümü belirlemek mümkün (LD50)değerlendirildi. Bu amaçla üç grup hayvan intrasisar olarak yabani tip 93/4286'nın 104 ila 106 CFU arasında değişen dozlarda ve mutant suş 93/4286ΩcssA ile 107 ila 109 CFU arasında enfekte edildi. . Genellikle, klinik parametrelerin azaltılması (örneğin, vücut ağırlığı ve sıcaklık) ve mortalite oranının artması enfeksiyondan sonra ilk 72 saat içinde meydana geldi. Yabani tip suşu için LD50 104 CFU meningokok meydan okuma karşılık gelirken, 105 CFU dozu ile mortalite oranı% 83.4 eşit ve 106 CFU ile 100%(Şekil 1A). Tersine, mutant suşu 93/4286ΩcssAiçin LD50 elde etmek için, bir doz gerekli olmuştur 108 CFU(Şekil 1B),bir miktar 10,000 kat daha yüksek yabani türü zorlanma göre.
Fare beyin dokularında N. menenjitidis uygun CFU değerlendirilmesi.
Enfekte hayvanların beyin dokusunda enfeksiyon kinetik takip etmek için, bir zaman ders tsay yabani tip veya cssA mutant suşu ile yapıldı25. I.cist'ten sonra. 93/4286 veya 93/4286ΩcssA suşları 5x105 CFU ile enjeksiyon, beyin dokusunda yabani tip bakterilerin hızlı bir artış vardı yaklaşık 24 saat sonrası enfeksiyon(Şekil 2A) en yüksek sayılara ulaşan tersine izojenik cssA-kusurlu mutant ile meydan farelerin beyninde, canlı sayıları 2.026 günlük CFU ± 1.774 72 h sonrası enfeksiyona kadar zaman içinde kademeli olarak düştü (Şekil 2A). Deney, mutant farelerin %33.3'ünün enfeksiyon bölgesinden bakteriyel açıklık gösterdiğini, yabani tip tespin enfeksiyonunun ise hayvanların beyninden asla yok edilemediğini göstermiştir.
Dalak ve karaciğer48h sonrası meydan meningokok yükü değerlendirilmesi.
Bu deney, enfekte farelerden gelen bakterilerin periferik organlardaki 48 saat sonrası temizliğini değerlendirmek için yapılmıştır. Bu amaçla, iki grup fareye 93/4286 veya 93/4286 ωcssA suşlarının 5 x 105 CFU'su ile enfekte olmuş ve enfekte farelerin dalak ve karaciğerinde bakteriyel canlı sayımlar değerlendirilmiştir25 (Şekil 2B). Meningokok enjeksiyonundan 48 saat sonra, cssA-kusurlumutant tamamen dalak ve karaciğerde temizlendi, yabani tip suşu ile enfekte hayvanlar kalıcı bir sistemik enfeksiyon çerçevesi sergiledi. 48 h sonra CFU ortalama değerleri gerçekten hala 3.212 log CFU ± 3.354 ve 6.949 log CFU ± 1.37 dalak ve karaciğer, sırasıyla idi. İki hayvan grubundaki karaciğer dokusundaki bakteri yükleri arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlıydı (P < 0.001 ile).
Şekil 1: 93/4286 yabani tip veya cssA-kusurlu N. menenjitidis suşları ile enfekte farelerin sağkalım. (A) Üç grup Balb/c faresi (n= 6/doz) i.cist enfekte edildi. ile 104, 105, ve 106 CFU / fare vahşi türü zorlanma 93/4286 ve (B) ile 107, 108, ve 109 CFU / fare izojenik cssA-kusurlu mutant. Fareler bir hafta boyunca izlendi ve hayatta kalma kaydedildi. Sonuçlar zaman içinde farklı dozlarda yüzde sağkalım olarak ifade edilir, günlük rütbe p değeri < 0.05 yabani türü suşu ile enfekte fareler için. Bu rakam Colicchio ve ark.25'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 93/4286 veya 93/4286ΩcssA suşları ile aşılanmış farelerde zaman içinde bakteri yüklerinin değerlendirilmesi. (A) I.cist'i takip eden beyin dokularında bakteri yüklerinin zaman seyri. Enfeksiyon. İki grup Balb/c faresi (n = 20/grup) i.cist tarafından enfekte edildi. 5 x 105 CFU ya vahşi tip zorlanma 93/4286 veya cssA-kusurlu mutant ile rota. Hayvanlar enfeksiyondan sonra 4, 24, 48 ve 72 saat kurban edildi. Beyinler hasat edildi, GC ortamda mekanik olarak homojenleştirildi ve uygun sayımlar belirlendi. Sonuçlar, aşılamadan sonra farklı zaman noktalarında organ başına CFU numaralarının ortalama ±SD günlüğü olarak ifade edilir. Yıldız işaretleri istatistiksel anlamlılık gösterir (**, P < 0.01). (B) Dalak ve karaciğerde zamanla bakteri yükleri. İki grup Balb/c faresi (n = 5/grup) i.cist enfekte edildi. 5 x 105 CFU ya vahşi tip zorlanma 93/4286 veya cssA-kusurlu mutant. Hayvanlar enfeksiyondan sonra 48 saat ötenaziye alındı. Dalak ve karaciğerler hasat edildi, mekanik homojenleştirildi ve uygun sayımlar belirlendi. Sonuçlar organ başına günlük CFU numaraları olarak ifade edilir. Yatay çubuklar, bakteri titrelerinin ortalama günlüklerini gösterir. Yıldız işaretleri istatistiksel anlamlılık gösterir (***, P < 0.001). Bu rakam Colicchio ve ark.25'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada erişkin farelerde meningokok menenjitini i.cist ile indükleyen deneysel bir protokol açıklanır. meningokok bakterilerinin aşılanması. Bilgimiz dahilinde, i.cist tarafından enfekte edilen laboratuvar farelerinde başka hiçbir meningokok menenjit modeli geliştirilmemiştir. rota; Geçmişte, bu şekilde hem sıçan31 ve tavşan32meningokok menenjit modelleri sağlamak için keşfedilmiştir. Meningokok hastalığının en yüksek oranının küçük çocuklar, ergenler ve genç yetişkinler arasında bulunduğu bilinmektedir33,34,35; Bu nedenle menenjit fare modelimizde yenidoğan veya bebek hayvanlarına odaklanmak yerine 8 haftalık immünyonlu hayvanlar kullanılmıştır.
Deneysel modelimizde i.cist kullanmaya karar verdik. inoculum doğrudan cisterna magna içine meningokok serbest sağlar gibi BOS bakteriyel replikasyon kolaylaştıran. Bu aşılama yolu fizyolojik olarak daha erişilebilir28 ve intrakranial subaraknoidal rota daha az travmatik, zaten Streptococcus spp nedeniyle menenjit gelişimi için kullanılan. 36,37. Meningokok enfeksiyonunun doğal yolunu temsil etmese de, bu bölgedeki bakteri enjeksiyonu fare sağkalım, bakteri yükleri, klinik parametreler ve ayrıca meningokok menenjitinin indüksiyonu için etkili olmuştur. histolojik analiz24,25,26. İlginçtir, referans zorlanma 93/4286 insan hastalığında gözlenen taklit histopatolojik özellikleri ile menenjit indüklenen24,25,26.
Standart bir murine enfeksiyonu kurmak ve araştırmacıların güvenliğini garanti altına almak için, taze bir bakteri büyüme24,25,30yerine bakteri titre dondurulmuş stok başlamak için tercih edildi, 38, dahası, biz hızlı bir ölümcül sonucu sınırlamak vebeyin hasarı2, 24,25,26gelişimine izin amacı ile canlı meningokok bir alt öldürücü doz kullanmaya karar verdi. Bununla birlikte, farklı suşlar için uygun bir enfeksiyöz dozu belirlemek için, ön deneyler yapılmalıdır. Bu çalışmada, bir serogroup C referans suşu 93/4286 ve izojenik mutant suş 93/4286ΩcssA 5 x 105 CFU/ fareler dozile test ettik.
Bu model kolonizasyon ve meningokok invazyonu ilk aşamalarında taklit etmese de, bakteriyel izole sadece BOS iyi büyür, ama aynı zamanda dalak ve karaciğer bölmelerinde kalmak mümkün. Neisseri enfeksiyonun hipoferremik evresinde, heme türetilmiş demirin çoğu karaciğer ferritini ile birleştirilir. Ferritin demir elde etmek için meningokok kullanılabilir gibi39, karaciğer bakteriyel replikasyon için bir hedef organ oluşturmaktadır.
Bu deneysel prosedürde, inbred Balb / c fare suşu başlangıçta meningokok menenjit modeli24geliştirmek için istihdam edildi outbred CD-1 suşu yerine kullanılmıştır . Outbred fareler insan popülasyonu 40 gibi değişken bir kohort çeşitli etkileri ortaya çıkarmak için daha uygun olabilir geniş bir genetik değişkenlik ile karakterize edildi41. Ancak, bu değişkenlik yeterli istatistiksel önemi elde etmek için daha yüksek bir örneklem büyüklüğüne ihtiyaç duyar ve prosedürlerin ve hedeflenen çalışmaların standardizasyonuna engel olabilir.
Meningokok dar konak aralığı rağmen, minür konak bakterilerin çoğaltılmasını sağlamak ve meningokokvivirt geliştirmek için, demir dextran enfeksiyon önce hayvanlara uygulandı6,14. Son olarak, menenjit diğer deneysel modeli ile karşılaştırıldığında, hayvanlar herhangi bir antibiyotik ile tedavi edilmedi, hastalığın seyrini etkilemez ve / veya inflamatuar yanıt profili26.
Bugüne kadar, bizim çalışmalar da i.cist vurgulanmıştır. model menenjit kurulmadan önce sepsis ve bakteriyemi oluşumu ile karakterize olan i.p. veya i.n. enfeksiyon modellerine göre hem menenjit hem de invaziv meningokok hastalığını indüklemek için fonksiyoneldir10,11 ,12,13,14,15,16,17. Bu nedenle, bu enfeksiyon modeli murine konak menenjit indüksiyon dayalı, sadece BOS içine doğrudan bakteri replikasyonunu önlemek için yenilikçi tedavi stratejisi değerlendirmek için değil, aynı zamanda olası pasif bağışıklık etkinliğini analiz etmek için yararlı olabilir insan patojenlerine karşı tedavi.
Ancak meningokok enfeksiyonu çok aşamalı bir süreçtir, nazofaset kolonizasyonu, kan dolaşımına erişim, kan beyin bariyerinin geçişi ve son olarak BOS'ta kontrolsüz çoğalma, modelimiz sadece bazı yönlerini yeniden üretir meningokok enfeksiyonu, kısmen bu sınırlamaları yıkmak için transgenik hayvan modeli meningokok hastalığının insan patogenezi taklit etmek yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Çalışmalar kısmen PRIN 2012 [hibe numarası 2012WJSX8K] tarafından desteklenmiştir: "Mukozal enfeksiyonlarda host-mikrop etkileşim modelleri: yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi" ve PRIN 2017 [2017SFBFER]: "Aralarındaki etkileşimi ele almak için entegre bir yaklaşım adaptasyon, stresli koşullar ve zorlu patojenlerin antimikrobiyal direnci".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 mm x 115 mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1 mL 25 G 5/8 inch | BD | 300014 | 05 mm x 16 mm |
| BD Plastipak syringe 5 mL | BD | 308062 | 07 mm x 30 mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to: 400 mL, Total Volume 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267 x 207 x 140 mm3, Floor area 370 cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5 mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0.10 x 0.06 mm2 tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200 g, d = 0.01 g, T = -1200 g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25 g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1 L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8 mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface: 15 mm x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000 mL |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90 x 14.2 mm2 |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20 μL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200 μLL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1,000 μL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250 g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1 kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5 mL |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor - ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume = 288 L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
References
- van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
- Colicchio, R., et al. Fitness Cost of Rifampin Resistance in Neisseria meningitidis: In vitro Study of Mechanisms Associated with rpoB H553Y Mutation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7637-7649 (2015).
- Talà, A., et al. Serogroup-specific interaction of Neisseria meningitidis capsular polysaccharide with host cell microtubules and effects on tubulin polymerization. Infection and Immunity. 82, 265-274 (2014).
- Pagliarulo, C., et al. Regulation and differential expression of gdhA encoding NADP-specific glutamate dehydrogenase in Neisseria meningitidis clinical isolates. Molecular Microbiology. 51, 1757-1772 (2004).
- Plant, L., Jonsson, A. B. Contacting the host: insights and implications of pathogenic Neisseria cell interactions. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 608-613 (2003).
- Schryvers, A. B., Stojiljkovic, I. Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria. Molecular Microbiology. 32, 1117-1123 (1999).
- Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J., Watt, S. M. Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae. Molecular Microbiology. 22, 941-950 (1996).
- de Vries, F. P., van Der Ende, A., van Putten, J. P., Dankert, J. Invasion of primary nasopharyngeal epithelial cells by Neisseria meningitidis is controlled by phase variation of multiple surface antigens. Infection and Immunity. 64, 2998-3006 (1996).
- Tinsley, C. R., Heckels, J. E. Variation in the expression of pili and outer membrane protein by Neisseria meningitidis during the course of the meningococcal infection. Journal of General Microbiology. 132, 2483-2490 (1986).
- Gorringe, A. R., et al. Experimental disease models for the assessment of meningococcal vaccines. Vaccine. 23, 2214-2217 (2005).
- Newcombe, J., et al. Infection with an avirulent phoP mutant of Neisseria meningitidis confers broad cross-reactive immunity. Infection and Immunity. 72, 338-344 (2004).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 26, 75-82 (1999).
- Salit, I. E., Tomalty, L. Experimental meningococcal infection in neonatal mice: differences in virulence between strains isolated from human cases and carriers. Canadian Journal of Microbiology. 30, 1042-1045 (1984).
- Salit, I. E., Tomalty, L. A neonatal mouse model of meningococcal disease. Clinical and Investigative Medicine. 9, 119-123 (1986).
- Mackinnon, F. G., Gorringe, A. R., Funnell, S. G., Robinson, A. Intranasal infection of infant mice with Neisseria meningitidis. Microbial Pathogenesis. 12, 415-420 (1992).
- Mackinnon, F. G., et al. Demonstration of lipooligosaccharide immunotype and cap- sule as virulence factors for Neisseria meningitidis using an infant mouse intranasal infection model. Microbial Pathogenesis. 15, 359-366 (1993).
- Yi, K., Stephens, D. S., Stojiljkovic, I. Development and evaluation of an improved mouse model of meningococcal colonization. Infection and Immunity. 71 (4), 1849-1855 (2003).
- Holbein, B. E., Jericho, K. W. F., Likes, G. C. Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains, and pathology. Infection and Immunity. 24, 545-551 (1979).
- Saukkonen, K. Experimental meningococcal meningitis in the infant rat. Microbial Pathogenesis. 4, 203-211 (1988).
- Johansson, L., et al.
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infection and Immunity. 75, 5609-5614 (2007).
- Join-Lambert, O., et al. Meningococcal interaction to microvasculature triggers the tissular lesions of purpura fulminans. Journal of Infection Disease. 208, 1590-1597 (2013).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Duménil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathogen. 9, 1003139 (2013).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77, 3578-3587 (2009).
- Colicchio, R., et al. Virulence traits of serogroup C meningococcus and isogenic cssA mutant, defective in surface-exposed sialic acid, in a murine model of meningitis. Infection and Immunity. , 00688-00718 (2019).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infection and Immunity. 57, 2425-2429 (1989).
- Beverly, K. S. Chapter 105 - Cerebrospinal Fluid Sampling Small Animal. Critical Care Medicine. , 448-452 (2009).
- Liechti, F. D., Grandgirard, D., Leppert, D., Leib, S. L. Matrix metalloproteinase inhibition lowers mortality and brain injury in experimental pneumococcal meningitis. Infection and Immunity. 82, 1710-1718 (2014).
- Pagliuca, C., et al. Novel Approach for Evaluation of Bacteroides fragilis Protective Role against Bartonella henselae Liver Damage in Immunocompromised Murine Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1750 (2016).
- Trampuz, A., Steinhuber, A., Wittwer, M., Leib, S. L. Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospi- nal fluid. BMC Infectious Diseases. 7, 116 (2007).
- Tuomanen, E. I., Saukkonen, K., Sande, S., Cioffe, C., Wright, S. D. Reduction of inflammation, tissue damage, and mortality in bacterial meningitis in rabbits treated with monoclonal antibodies against adhesion-promoting receptors of leukocytes. Journal of Experimental Medicine. 170, 959-969 (1989).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. Journal of Experimental Medicine. 129, 1307-1326 (1969).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity. Journal of Experimental Medicine. 129, 1327-1348 (1969).
- World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual, 2nd Edition. World Health Organization. , Geneva: WHO. (2011).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiolology. 4, 36 (2004).
- Zhang, S., et al. Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model. Journal of Visualized Experiments. (1), e137 (2018).
- Pagliuca, C., et al. Evidence of Bacteroides fragilis protection from Bartonella henselae-induced damage. PLoS One. 7, 49653 (2012).
- Larson, J. A., Howie, H. L., So, M. Neisseria meningitidis accelerates ferritin degradation in host epithelial cells to yield an essential iron source. Molecular Microbiology. 53, 807-820 (2004).
- Festing, M. F. W. Phenotypic variability of inbred and outbred mice. Nature. 263, 230-232 (1976).
- Festing, M. F. W. Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research. Neurobiology of Aging. 20, 237-244 (1999).
