Summary
Heri, en protokol til at gennemføre Morris vand labyrint tests for at evaluere evnen til læring og hukommelse af Alzheimers sygdom model mus og til at vurdere effekten af manuelle akupunktur til behandling af dem er beskrevet.
Abstract
En Morris Water Maze (MWM) eksperiment tvinger forsøgsdyr til at svømme og lære at finde en platform skjult i vandet. Det er almindeligt anvendt i videnskabelig forskning til at vurdere indlæring og hukommelse af dyr. På grund af den omfattende brug af MWM-testen er visuelle forsøgsprotokoller afgørende for forskerne. Dette manuskript bruger de seneste undersøgelser til at introducere protokollen for MWM-testen. Alzheimers sygdom (AD) er karakteriseret ved et progressivt tab af hukommelse og kognitiv funktion. En alternativ og supplerende behandling, der anvendes til AD er manuel akupunktur (MA). For at vurdere lærings-og hukommelses evnen i AD model-mus blev MWM-testen udført. Den synlige platform retssag, skjulte platform Trial, sonde Trial, og tilbageførsel retssag af MWM blev brugt til at evaluere rumlig læring og hukommelse evne. I den synlige platform retssag, svømning hastighed og flugt ventetid af mus i forskellige grupper var ikke signifikant anderledes. I den skjulte platform og tilbageførsel forsøg, viste annoncegruppen en lang flugt ventetid. Escape-Latensen faldt markant efter behandling med MA. Det lave platforms-crossover-nummer og andelen af tid i SW-kvadranten i sonde forsøget steg efter MA-behandlingen (p < 0,05 eller p < 0,01). Resultaterne af MWM-testene tyder på, at MA effektivt kan forbedre de rumlige lærings-og hukommelsesevner i annonce model-mus. Strenge eksperimentelle operationer gav sikkerhed for resultaternes pålidelighed.
Introduction
I øjeblikket, den MWM eksperiment er blevet den mest udbredte og standard adfærdsmæssige eksperiment til at evaluere den rumlige indlæring og hukommelse af dyr1. Det blev oprindeligt designet af den britiske psykolog Richard G. Morris og er konstant blevet forbedret. Mange fordele såsom minimal uddannelse, Cross-Species nytte, ufølsomhed over for forskelle i kropsvægt, og gentagne test evne af MWM gør det den bedste metode til vurdering af kognitiv funktion2. Alzheimers sygdom (AD) er et stort medicinsk problem, primært karakteriseret ved et fald i hukommelsen behandling og kognitiv funktion3. MWM er en uundværlig Eksperimentel metode til at evaluere lærings-og hukommelses evnen for annonce model dyrene og effektiviteten af interventionsmetoderne. MWM eksperimenter er generelt tidskrævende (6 – 11 dage) og involverer mange variable faktorer4. Selv om der er mange artikler om vand labyrint eksperimenter, i praksis, forskere mangler en sammenhængende protokol. Derfor er en intuitiv og stringent protokol proces video særlig vigtig. Ved hjælp af et tidligere eksperiment som eksempel5beskrives alle trinene i MWM. Ved hjælp af MWM, tidligere undersøgelser foreslog, at akupunktur kunne lindre symptomerne på annonce model mus5,6,7.
Heri, den MWM protokol, der anvendes i en nylig undersøgelse5 er beskrevet for at give en enkel og synlig metode for forskere til at vurdere den rumlige læring og hukommelse af annonce model dyr.
Protocol
Denne protokol blev godkendt af den animalske etiske komité i Beijing University of Chinese Medicine, og det var i overensstemmelse med alle retningslinjer for pleje og brug af forsøgsdyr i Kina. Der var ingen utilsigtet døds situation under forsøgs proceduren, og ingen dyr skulle være aflives i denne undersøgelse.
1. forberedelse
- Køb 30 mandlige SAMP8 mus og 10 mandlige SAMR1 mus (alder: 8 måneder).
- Mus hver for sig i individuelle ventilations bure ved en temperatur på 24 ± 2 °C og en 12 h mørk/lys cyklus.
- Fodre musene med en standard pellet kost tilgængelig ad libitum og give sterile drikkevand.
- Acclimate alle mus til miljøet i 5 dage før eksperimenter.
2. gruppering af dyr
- Opdel tilfældigt 30 SAMP8 mus i tre grupper (n = 10/gruppe): annoncegruppen, manual akupunktur (MA) gruppe, og medicin (M) gruppe.
- Brug 10 SAMR1 mus som normal kontrol (N) gruppe6.
3. administration af donepezil hydrochlorid tabletter
- Du skal knuse en donepezil hydrochlorid tablet (5 mg/tablet) og opløse den i 50 mL destilleret vand.
- Medicinen blev fremstillet i trin 3,1 ved doser på 1 mg/kg til musene ved hjælp af en oral sonde en gang om dagen8 under hele forsøget, herunder de dage, hvor ma-behandlingen og MWM-testene udføres.
4. administration af manuel akupunktur
- Immobilize musene i MA-gruppen i muse poser.
- Brug engangs sterile Akupunktur nåle (0,25 mm x 13 mm) og anvende den flade torn metode af MA på Baihui (GV20) og Yintang (GV29)5 mod næsen i 20 min. Sørg for, at nåle dybden er 0,2 – 0,3 cm.
- Med en hastighed på ca. 180 r/min hver 5 min for ~ 15 s hver gang under hele eksperimentet, herunder dage, hvor der udføres MA-behandling og MWM-tests. 90
5. MWM-test
Bemærk: ved 24 timer efter de 15 på hinanden følgende dages behandling, underkastes musene i de fire grupper til MWM-testen. Gennemføre den synlige platform retssag, skjulte platform Trial, sonde retssag, og tilbageførsel retssag i rækkefølge.
- Forbered dig på MWM-testen.
- Position MWM enhed og signal erhvervelse og behandling system i et eksperiment rum designet til at opretholde lydisolering.
- Sæt en cirkulær hvid tank (diameter = 90 cm, højde = 50 cm) omgivet af en uigennemsigtig klud i midten af MWM-enheden.
- Fastgør et videokamera til loftet på MWM-enheden, og forbind det til en videobåndoptager med et automatiseret sporingssystem for at indsamle dataene.
- Opdel vand labyrinten tank lige i fire lige store regioner ved hjælp af to vinkelret linjer, mærket nord (N), syd (S), øst (E), og vest (W). Opdel poolområdet konceptuelt i fire kvadranter af samme størrelse (NE, NW, SW og SE).
- Inden for synet af musen, placere visuelle signaler af forskellige former på væggen af hver kvadrant som visuelle referencer (f. eks, firkanter, trekanter, og cirkler).
Bemærk: distale signaler er dyrets navigationsreferencepunkter til lokalisering af platformen. Flyt dem derfor ikke under testen. Forskeres stilling er en potentiel distale cue og kan påvirke MWM. Derfor bør forskeren holde sig ude af synet af musene, mens de venter på dyret til at udføre testen. - Fyld den cirkulære beholder med vand til en dybde på 30 cm og vedligehold ved 22 ± 2 °C med en elektrisk radiator.
- Gøre vandet uigennemsigtigt med ca. 150 g mælkepulver.
- Udfør den synlige platforms prøveversion.
- Placer en plastik cirkulær platform (diameter = 9,5 cm; højde = 28 cm) 1 cm over vandoverfladen i enhver kvadrant tilfældigt.
- Sæt et sort flag på platformen.
- Slip hver mus forsigtigt i vandet på vandstanden fra en af de fire startplaceringer, som vender mod tank væggen. Drop ikke musen i vandet.
- Aktiver computer tracking program, så snart musen er frigivet i vandet.
- Giv hver mus 60 s til at søge efter platformen. Ved afslutningen af hvert forsøg, placere hver mus på platformen og tillade det at blive på det for 10 – 30 s.
- Overhold svømme forløbskurver for musene på computeren, Optag den tid, musen tog for at finde platformen som flugt ventetid, og analysér svømme hastigheden.
- Tør hver mus med håndklæder og varm den med en elektrisk radiator. Sørg for at bruge en passende varme kilde for at forhindre, at dyret overophedes.
Bemærk: Placer hver mus i puljen på hver af de fire forskellige start kvadranter for fire forsøg, flytte platformen til en anden placering med hver efterfølgende retssag. Intervallet mellem to forsøg med hver mus er 15 – 20 min.
- Udfør den skjulte platform Trial/Place navigation test.
- Placer den samme platform uden et flag i SE-kvadranten.
- Placer tilfældigt musen i puljen fra hver af de fire kvadranter (NE, NW, SW, N) overfor poolvæggen for fire forsøg. Brug et tidsinterval på 15 – 20 minutter mellem to forsøg.
- Giv hver mus 60 s til at søge efter den skjulte platform.
- Optag Escape latency af hvert forsøg, efter at musen klatrer op til platformen for efterfølgende analyse.
- Tør hver mus med håndklæder og varm den med en elektrisk radiator.
Bemærk: Udfør den skjulte platforms prøve fra dag 2 − 6. Hvis musen ikke kan finde platformen i 60 s, føre musen til at klatre op til platformen og gøre det muligt at blive der for 10 – 30 s i slutningen af hvert forsøg. Udfør fire forsøg/dag for hver mus i 5 på hinanden følgende dage, med platformen og de visuelle signaler på konstante positioner.
- Udfør sonde forsøget.
Bemærk: Find hver mus i puljen på en roman startposition til at observere den rumlige udforskning evne af musen.- Fjern platformen.
- Find hver mus, der vender mod tank væggen i puljen én gang for 60 s. Sørg for, at udgangsstedet er den NW kvadrant, som er den kvadrant længst væk fra SE-kvadranten.
- Optag svømning afstand, svømning hastighed, og platformen crossover nummer i labyrinten.
- Tør hver mus med håndklæder og give varme efter retssagen.
- Udfør den omvendte prøveversion.
Bemærk: Udfør den omvendte prøveperiode fra dag 8 − 11.- Placer platformen i midten af NW kvadrant (i stedet for SE kvadrant).
- Følg trin 5.3.2 − 5.3.5 som beskrevet i afsnittet test af skjulte platforme.
6. statistisk analyse
- Brug statistik software (f. eks SPSS 20,0) til at udføre den statistiske analyse.
Representative Results
Tidsakse diagrammet i denne protokol er vist i figur 1.
Figur 1: tidsakse diagram i forsøgsprotokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tidsaksen viser, at dette eksperiment varede i alt 21 dage. Behandlingen blev anvendt på musen under hele forsøget, og MWM-testene begyndte efter 15 dages behandling. Den synlige platform, skjulte platform, sonde, og tilbageførsel forsøg blev udført i rækkefølge.
Tidligere udgivne resultater fra Ding et al.5 præsenteres som typiske resultater af MWM figur 2.
Figur 2: typiske resultater af Morris Water Maze-testen (n = 10). (A) ændringer i flugten ventetid og svømning hastighed af rotter blandt de forskellige grupper i den synlige platform retssag. (B) ændringer i Escape latency af rotter blandt de forskellige grupper i den skjulte platform og tilbageførsel forsøg. P-værdierne er * p < 0,05 og * * p < 0,01 sammenlignet med kontrolgruppen. Symbolet # # angiver p < 0,01 sammenlignet med annoncegruppen. (C) ændringer i platformens crossover-nummer og den procentdel af tiden, som rotterne har brugt i den nordvestlige kvadrant blandt de forskellige forsøgsgrupper i sonde forsøget. Resultaterne af den synlige platform, skjulte platform og tilbageførsel retssag i hver gruppe vises (n = 10, gennemsnit ± SD). Dette tal er blevet ændret fra Ding et al5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2a viser resultaterne af det synlige platforms forsøg. Ingen statistiske forskelle blev observeret i Escape latency eller svømning hastighed blandt grupperne på den første dag i MWM. Figur 2b viser resultaterne af den skjulte platform og tilbageførselsprøve fra dag 2 − 6 og dag 8 − 11. Annoncegruppens flugt ventetid forblev på et højt niveau på hver dag i testen. De tre andre gruppers flugt ventetid faldt gradvist. Flugt forsinkelsen fra dag 3 − 6 og dag 8 − 11 var længere i annoncegruppen end i kontrolgruppen (p < 0,01). Escape-latenterne for mus i MA-og lægemiddel grupperne var kortere end for mus i annoncegruppen på dag 2 − 6 og dag 8 − 11 (p < 0,01). Figur 2c viser resultaterne af sonde forsøget. Platformen, der krydsede antallet af mus i annoncegruppen, var statistisk lavere end i kontrolgruppen (p < 0,01). Platformens crossover-nummer i MA-gruppen var højere end i annoncegruppen (p < 0,05). Den del af tiden, der blev brugt i SW kvadrant af mus i annoncegruppen, var betydeligt lavere end i kontrolgruppen (p < 0,01). Den del af tiden, der er brugt i SW kvadrant i MA-gruppen, var højere end i annoncegruppen (p < 0,01).
Discussion
Selv om mange vand labyrinter, herunder Biel vand labyrint og Cincinnati vand labyrint, har eksisteret i mindst et århundrede, kun MWM har været meget brugt til effektivt og objektivt evaluere rumlig læring og hukommelse evne, fordi det har mange fordele9. Trods omfattende brug af MWM, er proceduren ikke altid blevet brugt optimalt. MWM-eksperimenter tager generelt lang tid og påvirkes af mange variable faktorer. Der er nogle effektive og pålidelige aspekter, der hjælper med at opdage ændringer i rumlig indlæring og hukommelse evne, der bør tages i betragtning.
Der blev udført fire forskellige MWM-forsøg. Den synlige platform retssag blev brugt på dag 1 af MWM. Hvis dyrene kunne svømme direkte til platformen, det indikerede, at svømning evne og vision af dyrene var normal10. Otnass foreslog, at den synlige platform retssag skal gennemføres først11. Resultaterne af det synlige platforms forsøg i denne undersøgelse betød, at de fire grupper startede på samme lærings niveau. Derfra kunne de successive eksperimenter påbegyndes. Den skjulte platform Trial blev brugt til at vurdere musens evne til at erhverve indlæring og hukommelse evne. Sonde forsøget blev udført på dag 7, 24 timer efter afslutningen af den skjulte platform retssag, for at vurdere arbejdshukommelsen. Endelig blev tilbageførselsforsøget brugt til at vurdere arbejdshukommelsen2. Ændringerne i de fire forskellige forsøg med MWM sammen indikerede, at annonce modellens mus havde lav indlærings-og hukommelses evne, og at MA havde en positiv effekt på AD5.
Der er ingen specifikke standarder for dimensionerne af puljen og platform1. En pulje på 214 cm i diameter anvendes i de fleste MWM-studier. Vorhees og Williams viste, at med identiske protokoller, rotter lære hurtigere i en 122-cm pulje end i en 210-cm pool; den stejle hældning af indlæringskurven indikerer, at den 122-cm diameter pulje er ekstremt let for rotter at navigere12. I den nuværende protokol, i betragtning af den gamle alder og svage statur af AD-mus, en 90-cm diameter pulje og 9,5-cm diameter platform blev brugt. Resultaterne af de indledende eksperimenter indikerede, at mus havde sværere ved at finde platformen i en pulje med større diameter. Derfor repræsenterer tests i større puljer ikke den reelle forskel mellem grupperne. Forsøgsdyr havde sværere ved at finde platformen i en større pulje med en mindre platform4. Derfor, størrelsen af puljen og platformen skal optimeres i indledende eksperimenter i henhold til de eksperimentelle krav og tilstand af forsøgsdyr.
Vand ved temperaturer fra 20 – 24 °C anbefales til udførelse af MWM-testen4. Alderen forsøgsdyr udført dårligt i koldt vand13, hvilket indikerer et klart aldersbetinget tab af termoregulering14. I denne undersøgelse blev en termostat placeret i bunden af puljen for at opretholde temperaturen af vandet ved 20 – 24 °C. Undersøgelsens resultater viste ingen signifikant forskel i svømme hastigheden blandt de fire grupper5.
MWM er en kraftfuld teknik til at vurdere kognitiv funktion og er meget udbredt i undersøgelser i øjeblikket. Men der er ingen defineret, standard, konsekvent udstyr til at udføre MWM test, herunder størrelser af puljen og platform15,16. Forskellige laboratorier har forskellige specifikationer for MWM. Derfor vælger forskerne den rette eksperimentelle anordning i henhold til deres individuelle eksperimentelle krav, hvilket kan skabe forvirring blandt forskerne. Indledende eksperimenter er også nødvendige. Flere undersøgelser skal udføres på grundlæggende eksperimenter som MWM. I øjeblikket, fleksibiliteten i MWM som et eksperimentelt værktøj kun ligger i evnen til at vælge de grundlæggende protokoller i henhold til undersøgelsen foreslået. Derfor kan denne test anvendes til at vurdere kognitiv funktion i større dybde.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke nogen potentiel interessekonflikt.
Acknowledgments
Huiling Tian og ning Ding er co-første forfattere. Zhigang Li og Jing Jiang er co-tilsvarende forfattere. Denne forskning blev støttet af tilskud fra Kinas National Natural Science Foundation (Grant nr. 81804178, 81473774 og 81503654). Protokollen og resultaterne beskrevet heri stammer fra artiklen, "inddragelse af manuel akupunktur regulerer adfærd og cerebral blodgennemstrømning i SAMP8 muse model af Alzheimers sygdom" af Dr. ning Ding et al.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acupuncture needles | Beijing Zhongyan Taihe Medical Instrument Limited Company | 511526 | |
| desktop computer | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | Lenovo T4700D | |
| Donepezil Hydrochloride Tablet | Eisai China | H20050978 | Aricept |
| mice | Zhi Shan (Beijing) Academy of Medical Science | SCXK2014-0003 | |
| Mirros water maze device | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | WMT-100S | |
| mouse bags | home-made | ||
| Signal acquisition and processing system | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | BL-420N |
References
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Value of water mazes for assessing spatial and egocentric learning and memory in rodent basic research and regulatory studies. Neurotoxicology Teratology. 45, 75-90 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocol. 1 (2), 848-858 (2006).
- The state of the art of dementia research: New frontiers; World Alzheimer Report 2018. Alzheimer's Disease International. 9, 1-46 (2018).
- Vorhees, C. V., et al. Effects of neonatal (+)-methamphetamine on path integration and spatial learning in rats: effects of dose and rearing conditions. International Journal of Developmental Neuroscience. 26 (6), 599-610 (2008).
- Ding, N., Jiang, J., Xu, A., Tang, Y., Li, Z. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 13, 37 (2019).
- Ding, N., et al. Manual acupuncture suppresses the expression of proinflammatory proteins associated with the NLRP3 inflammasome in the hippocampus of SAMP8 mice. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2017, 1-8 (2017).
- Cao, J., et al. Behavioral changes and hippocampus glucose metabolism in APP/PS1 transgenic mice via electro-acupuncture at governor vessel acupoints. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 5 (2017).
- Amy, E., et al. Effects of sub-chronic donepezil on brain Abeta and cognition in a mouse model of Alzheimer's disease. Psychopharmacology. 230, 279-289 (2013).
- Garthe, A., Kempermann, G. An old test for new neurons: refining the Morris water maze to study the functional relevance of adult hippocampal neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 7, 63 (2013).
- Schoenfeld, R., Schiffelholz, T., Beyer, C., Leplow, B., Foreman, N. Variants of the Morris water maze task to comparatively assess human and rodent place navigation. Neurobiology of Learning and Memory. 139, 117-127 (2017).
- Otnass, M. K., Brun, V. H., Moser, M., Moser, E. I. Pretraining prevents spatial learning impairment after saturation of hippocampal long-term potentiation. Journal of Neuroscience. 19 (24), 49 (1999).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. Ilar Journal. 55 (2), 310-332 (2014).
- Vorhees, C. V., Skelton, M. R., Williams, M. T. Age-dependent effects of neonatal methamphetamine exposure on spatial learning. Behavioural Pharmacology. 18 (5-6), 549-562 (2007).
- Iivonen, H., Nurminen, L., Harri, M., Tanila, H., Puoliväli, J. Hypothermia in mice tested in Morris water maze. Behaviour Brain Research. 141 (2), 207-213 (2003).
- Lin, S. Y., et al. Ozone inhibits APP/Aβ production and improves cognition in an APP/PS1 transgenic mouse model. Neuroscience. , (2019).
- Zuo, Y., et al. Preoperative vitamin-rich carbohydrate loading alleviates postoperative cognitive dysfunction in aged rats. Behavioural Brain Research. 373, 112107 (2019).
