Verbetering van kleine RNA-SEQ: minder bias en betere detectie van 2 '-O-methyl Rna's
Summary
We presenteren een gedetailleerd klein RNA Library Reparatie protocol met minder bias dan standaardmethodes en een verhoogde gevoeligheid voor 2 ‘-O-methyl rna’s. Dit protocol kan worden gevolgd met behulp van zelfgemaakte reagentia om kosten te besparen of kits te gebruiken voor het gemak.
Abstract
De studie van kleine Rna’s (Srna’s) door Next-generation sequencing (NGS) wordt uitgedaagd door bias issues tijdens de voorbereiding van de bibliotheek. Verschillende types sRNA zoals plant microRNAs (miRNAs) dragen een 2 ‘-O-methyl (2 ‘-OMe) modificatie op hun 3 ‘ terminale nucleotide. Deze wijziging voegt een andere moeilijkheid toe omdat het 3 ‘ adapterligatie remt. We hebben eerder aangetoond dat gewijzigde versies van het Protocol ‘ TruSeq (TS) ‘ minder bias en een verbeterde detectie van 2 ‘-OMe Rna’s hebben. Hier beschrijven we in detail Protocol ‘ TS5 ‘, die de beste algehele prestaties toonde. TS5 kan worden gevolgd met behulp van zelfgemaakte reagentia of reagentia uit de TS-Kit, met gelijke prestaties.
Introduction
Kleine Rna’s (Srna’s) zijn betrokken bij de beheersing van een diversiteit aan biologische processen1. De eukaryotische regelgevende Srna’s zijn meestal tussen de 20 en 30 NT groot; de drie belangrijkste types zijn microRNAs (miRNA), piwi-interageren Rna’s (piRNA) en kleine storende Rna’s (siRNA). Afwijkende miRNA-uitdrukkings niveaus zijn betrokken bij een verscheidenheid aan ziekten2. Dit onderstreept het belang van miRNAs in gezondheid en ziekte en de eis voor nauwkeurige, kwantitatieve onderzoeksinstrumenten om Srna’s in het algemeen te detecteren.
Next-generation sequencing (NGS) is een veelgebruikte methode om Srna’s te bestuderen. De belangrijkste voordelen van NGS in vergelijking met andere benaderingen, zoals kwantitatieve PCR-of Microarray technieken (qPCR), zijn dat het geen a priori kennis van de sRNA-sequenties nodig heeft en daarom kan worden gebruikt om nieuwe Rna’s te ontdekken, en bovendien lijdt het minder achtergrond signaal en verzadiging effecten. Verder kan het enkele nucleotide-verschillen detecteren en heeft het een hogere doorvoer dan micro arrays. Echter, NGS heeft ook een aantal nadelen; de kosten van een reeks sequentiëren blijven relatief hoog en het proces voor meerdere stappen dat nodig is om een steekproef in een bibliotheek voor sequentiëren te converteren, kan biases introduceren. In een typisch sRNA Library voorbereidingsproces, een 3 ‘ adapter wordt eerst geligeerd aan de sRNA (vaak gel-gezuiverd van totaal RNA) met behulp van een afgeknotte versie van RNA ligase 2 (RNL2) en een voorgeadenyleerd 3 ‘ adapter (Figuur 1) bij afwezigheid van ATP. Dit verhoogt de efficiëntie van sRNA-adapter ligatie en vermindert de vorming van nevenreacties zoals sRNA circularisatie of concatemerization. Vervolgens wordt een 5 ‘-adapter geligeerd door RNA ligase 1 (RNL1), gevolgd door omgekeerde transcriptie (RT) en PCR-versterking. Al deze stappen kunnen vooroordelen3,4introduceren. Daarom lezen getallen mogelijk niet werkelijke sRNA expressieniveaus leidt tot kunstmatige, methode afhankelijke expressie patronen. Specifieke Srna’s kunnen ofwel over-of ondervertegenwoordigd zijn in een bibliotheek, en sterk ondervertegenwoordigd Srna’s kunnen ontsnappen aan detectie. De situatie is bijzonder gecompliceerd met plantaardige Mirna’s, Sirna’s in insecten en planten, en Pirna’s in insecten, nematoden en zoogdieren, waarbij de 3 ‘ terminale nucleotide een 2 ‘-O-methyl (2 ‘-OMe) modificatie1heeft. Deze modificatie remt sterk 3 ‘ adapter ligatie5, waardoor bibliotheek voorbereiding voor dit soort RNA een moeilijke taak.
Vorige werk toonde aan dat de ligatie van de adapter ernstige bias introduceert, als gevolg van RNA-sequentie/structuur-effecten6,7,8,9,10,11. Stappen stroomafwaarts van de ligatie van de adapter, zoals omgekeerde transcriptie en PCR, dragen niet significant bij aan bias6,11,12. Ligatie bias is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat adapter moleculen met een bepaalde sequentie zullen interageren met sRNA moleculen in het reactiemengsel om co-plooien te vormen, die ofwel kunnen leiden tot gunstige of ongunstige configuraties voor ligatie (Figuur 2). Gegevens van Sorefan et al7 SUGGEREREN dat RNL1 de voorkeur geeft aan een enkele gestrande context, terwijl RNL2 een dubbele streng prefereert voor ligatie. Het feit dat de adapter/sRNA co-fold structuren worden bepaald door de specifieke adapter en sRNA sequenties verklaart waarom specifieke sRNA zijn over-of ondervertegenwoordigd met een bepaalde Adapterset. Het is ook belangrijk op te merken dat binnen een reeks sRNA-bibliotheken die moeten worden vergeleken, dezelfde adapter sequenties moeten worden gebruikt. Sterker nog, het is eerder waargenomen dat het veranderen van adapters door de invoering van verschillende barcode sequenties verandert Mirna profielen in sequencing bibliotheken9,13.
Randomisatie van adapter sequenties in de buurt van het ligatie knooppunt vermindert waarschijnlijk deze biases. Sorefan en collega’s7 gebruikte adapters met 4 willekeurige nucleotiden aan hun extremiteiten, aangewezen “High Definition” (HD) adapters, en toonde aan dat het gebruik van deze adapters leiden tot bibliotheken die beter weerspiegelen echte Srna expressieniveaus. Meer recent werk bevestigde deze waarnemingen en bleek dat de gerandomiseerde regio niet hoeft te worden grenzend aan de ligatie junctie11. Dit nieuwe type adapters kreeg de naam “MidRand” adapters. Samen tonen deze resultaten aan dat een verbeterd adapter ontwerp de bias kan verminderen.
In plaats van de adapters te wijzigen, kan bias worden onderdrukt door het optimaliseren van reactieomstandigheden. Polyethyleenglycol (PEG), een macromoleculaire verdringings middel waarvan bekend is dat het de ligatie-efficiëntie14verhoogt, is aangetoond dat het de bias15,16significant vermindert. Op basis van deze resultaten verschenen er verschillende “low bias” kits op de markt. Deze omvatten kits die gebruik maken van PEG in de ligatie reacties, hetzij in combinatie met klassieke adapters of HD-adapters. Andere kits Vermijd ligatie helemaal, en gebruik 3 ‘ polyadenylering en sjabloon switching voor 3 ‘ en 5 ‘ adapter optellen, respectievelijk12. In nog een andere strategie, 3 ‘ adapter ligatie wordt gevolgd door een circularisatie stap, dus weglaten 5 ‘ adapter ligatie17.
In een eerdere studie zochten we naar een sRNA Library Preparation protocol met de laagst mogelijke niveaus van bias en de beste detectie van 2 ‘-OMe RNAs12. We testten enkele van de bovengenoemde ‘ low bias ‘ kits, die een betere detectie hadden van 2 ‘-OMe Rna’s dan het standaardprotocol (TS). Verrassend echter, bij modificatie (het gebruik van gerandomiseerde adapters, PEG in de ligatie reacties en verwijdering van overtollige 3 ‘ adapter door zuivering) de laatste presteerde beter dan de andere protocollen voor de detectie van 2 ‘-OMe Rna’s. Hier beschrijven we in detail een protocol op basis van het TS-protocol, ‘ TS5 ‘, dat de beste algemene detectie van 2 ‘-OMe Rna’s had. Het protocol kan worden gevolgd met behulp van reagentia uit de TS-Kit en één reagens uit de ‘ NF ‘ Kit of, om geld te besparen, met behulp van zelfgemaakte reagentia, met gelijke prestaties. We bieden ook een gedetailleerd protocol voor de zuivering van sRNA van totaal RNA en de bereiding van preadenylated 3 ‘-adapter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kleine RNA-bibliotheek voorbereiding blijft uitdagend vanwege bias, voornamelijk geïntroduceerd tijdens de ligatie stappen van de adapter. Rna’s met een 2 ‘-OMe modificatie op hun 3 ‘ einde zoals plant miRNAs, piRNA in insecten, nematoden en zoogdieren, en kleine interfererende Rna’s (siRNA) in insecten en planten zijn bijzonder moeilijk te bestuderen omdat de 2 ‘-OMe modificatie remt 3 ‘ adapter ligatie. In de literatuur zijn een aantal oplossingen voorgesteld om de protocollen voor het opstellen van sRNA Library te ve…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door het National Center for Scientific Research (CNRS), de Franse alternatieve energieën en de Atomic Energy Commission (CEA) en de Paris-Sud Universiteit. Alle bibliotheek voorbereiding, Illumina-sequencing en bio-informatica analyses voor deze studie werden uitgevoerd bij de I2BC Next-generation sequencing (NGS) faciliteit. De leden van de I2BC NGS-faciliteit worden erkend voor het kritisch lezen van het manuscript en nuttige suggesties.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes |
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
- Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
- Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
- Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
- Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
- Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
- Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
- Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).
