Verbesserung der kleinen RNA-Seq: Weniger Voreingenommenheit und bessere Detektion von 2'-O-Methyl RNAs
Summary
Wir präsentieren ein detailliertes reparaturbasiertes Analyseprotokoll für kleine RNA-Bibliotheken mit weniger Voreingenommenheit als Standardmethoden und einer erhöhten Empfindlichkeit für 2′-O-Methyl-RNAs. Dieses Protokoll kann mit hausgemachten Reagenzien befolgt werden, um Kosten zu sparen oder Kits für die Bequemlichkeit zu verwenden.
Abstract
Die Untersuchung kleiner RNAs (sRNAs) durch Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) wird durch Voreingenommenheitsprobleme während der Bibliotheksvorbereitung in Frage gestellt. Mehrere Arten von sRNA, wie z. B. pflanzliche microRNAs (miRNAs), tragen eine 2′-O-Methyl(2′-OMe) Modifikation an ihrem 3′ Terminalnukleotid. Diese Änderung fügt eine weitere Schwierigkeit hinzu, da sie 3′ Adapterligation hemmt. Wir haben zuvor gezeigt, dass modifizierte Versionen des ‘TruSeq (TS)’-Protokolls weniger Voreingenommenheit und eine verbesserte Erkennung von 2′-OMe RNAs haben. Hier beschreiben wir im Detail Protokoll ‘TS5’, das die beste Gesamtleistung zeigte. TS5 kann entweder mit hausgemachten Reagenzien oder Reagenzien aus dem TS-Kit mit gleicher Leistung verfolgt werden.
Introduction
Kleine RNAs (sRNAs) sind an der Kontrolle einer Vielfalt biologischer Prozesse beteiligt1. Eukaryotische regulatorische sRNAs sind in der Regel zwischen 20 und 30 nt groß; Die drei Haupttypen sind microRNAs (miRNA), piwi-interagierende RNAs (piRNA) und kleine störende RNAs (siRNA). Aberrante miRNA-Expressionsniveaus wurden in eine Vielzahl von Krankheiten verwickelt2. Dies unterstreicht die Bedeutung von miRNAs in Gesundheit und Krankheit und die Forderung nach genauen, quantitativen Forschungsinstrumenten zum Nachweis von sRNAs im Allgemeinen.
Die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) ist eine weit verbreitete Methode zum Untersuchen von sRNAs. Die Hauptvorteile von NGS im Vergleich zu anderen Ansätzen, wie quantitativepcR- oder Mikroarray-Techniken (qPCR), bestehen darin, dass es keine a priori-Kenntnisse der sRNA-Sequenzen benötigt und daher verwendet werden kann, um neuartige RNAs zu entdecken, und darüber hinaus leidet es weniger unter Hintergrundsignal- und Sättigungseffekte. Darüber hinaus kann es einzelne Nukleotidunterschiede erkennen und hat einen höheren Durchsatz als Mikroarrays. NGS hat jedoch auch einige Nachteile; Die Kosten für einen Sequenzierungslauf bleiben relativ hoch, und der mehrstufige Prozess, der zum Konvertieren einer Stichprobe in eine Bibliothek für die Sequenzierung erforderlich ist, kann zu Verzerrungen führen. In einem typischen sRNA-Bibliotheksvorbereitungsprozess wird ein 3′-Adapter zunächst mit einer abgeschnittenen Version von RNA Ligase 2 (RNL2) und einem vorgefertigten 3′-Adapter(Abbildung 1) in Abwesenheit von ATP an die sRNA (oft gelgereinigt von der Gesamt-RNA) gebunden. Dies erhöht die Effizienz der sRNA-Adapterligation und reduziert die Bildung von Seitenreaktionen wie sRNA-Zirkularisation oder Konthespirierung. Anschließend wird ein 5′-Adapter durch RNA Ligase 1 (RNL1) ligiert, gefolgt von Reverse Transkription (RT) und PCR-Verstärkung. Alle diese Schritte können Voreingenommenheit3,4einführen. Folglich spiegeln Lesezahlen möglicherweise nicht die tatsächlichen sRNA-Expressionsniveaus wider, die zu künstlichen, methodenabhängigen Expressionsmustern führen. Bestimmte sRNAs können in einer Bibliothek entweder über- oder unterrepräsentiert sein, und stark unterrepräsentierte sRNAs können der Erkennung entgehen. Besonders kompliziert ist die Situation bei pflanzlichen miRNAs, siRNAs in Insekten und Pflanzen und piRNAs bei Insekten, Nematoden und Säugetieren, bei denen das 3′ Terminalnukleotid eine 2′-O-Methyl(2′-OMe)-Modifikationhat 1. Diese Modifikation hemmt die 3′ Adapterligation5stark, was die Bibliotheksvorbereitung für diese Arten von RNA zu einer schwierigen Aufgabe macht.
Frühere Arbeiten zeigten, dass Adapterligation aufgrund von RNA-Sequenz-/Struktureffekten6,7,8,9,10,11eine schwerwiegende Verzerrung einführt. Schritte nach der Adapterligation wie Reverse Transkription und PCR tragen nicht wesentlich zur Verzerrung6,11,12bei. Ligationsverzerrung ist wahrscheinlich aufgrund der Tatsache, dass Adaptermoleküle mit einer bestimmten Sequenz mit sRNA-Molekülen in der Reaktionsmischung interagieren, um Co-Folds zu bilden, die entweder zu günstigen oder ungünstigen Konfigurationen für Ligation führen können (Abbildung 2). Daten von Sorefan et al7 deuten darauf hin, dass RNL1 einen einzelnen gestrandeten Kontext bevorzugt, während RNL2 einen Doppelstrang für Ligation bevorzugt. Die Tatsache, dass die Adapter/sRNA-Ko-Faltstrukturen durch die spezifischen Adapter- und sRNA-Sequenzen bestimmt werden, erklärt, warum bestimmte sRNA mit einem gegebenen Adaptersatz über- oder unterrepräsentiert sind. Es ist auch wichtig zu beachten, dass innerhalb einer Reihe von sRNA-Bibliotheken verglichen werden sollten, die gleichen Adaptersequenzen verwendet werden sollten. In der Tat wurde bisher beobachtet, dass das Ändern von Adaptern durch die Einführung verschiedener Barcodesequenzen miRNA-Profile in Sequenzierungsbibliotheken9,13verändert.
Die Randomisierung von Adaptersequenzen in der Nähe des Ligationsknotens reduziert diese Verzerrungen wahrscheinlich. Sorefan und Kollegen7 verwendeten Adapter mit 4 zufälligen Nukleotiden an ihren Extremitäten, die als “High Definition” (HD) Adapter bezeichnet wurden, und zeigten, dass die Verwendung dieser Adapter zu Bibliotheken führt, die echte sRNA-Expressionsniveaus besser widerspiegeln. Neuere Arbeiten bestätigten diese Beobachtungen und zeigten, dass die randomisierte Region nicht an die Ligationskreuzung11angrenzen muss. Diese neuartige Art von Adaptern wurde “MidRand” Adapter genannt. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass ein verbessertes Adapterdesign Verzerrungen reduzieren kann.
Anstatt die Adapter zu modifizieren, kann Die Verzerrung durch die Optimierung der Reaktionsbedingungen unterdrückt werden. Polyethylenglykol (PEG), ein makromolekulares Crowding-Mittel, das bekanntermaßen die Ligationseffizienz14erhöht, hat gezeigt, dass es die Verzerrung15,16signifikant reduziert. Basierend auf diesen Ergebnissen erschienen mehrere “Low Bias”-Kits auf dem Markt. Dazu gehören Kits, die PEG in den Ligationsreaktionen verwenden, entweder in Kombination mit klassischen Adaptern oder HD-Adaptern. Andere Kits vermeiden Ligation ganz, und verwenden 3′ Polyadenylierung und Template-Switching für 3′ und 5′ Adapter Addition, bzw.12. In einer weiteren Strategie folgt 3′ Adapterligation durch einen Zirkularisierungsschritt, wodurch 5′ Adapterligation17weggelassen wird.
In einer früheren Studie haben wir nach einem sRNA-Bibliotheksvorbereitungsprotokoll mit den geringstmöglichen Voreingenommenheitsgraden und der besten Detektion von 2′-OMe RNAs12gesucht. Wir haben einige der oben genannten “Low Bias”-Kits getestet, die eine bessere Erkennung von 2′-OMe RNAs als das Standardprotokoll (Standard Protocol, TS) hatten. Überraschenderweise jedoch bei der Modifikation (die Verwendung von randomisierten Adaptern, PEG in den Ligationsreaktionen und Entfernung von überschüssigen 3′ Adapter durch Reinigung) übertraf letztere die anderen Protokolle für die Erkennung von 2′-OMe RNAs. Hier beschreiben wir detailliert ein Protokoll, das auf dem TS-Protokoll ‘TS5′ basiert und die beste Gesamterkennung von 2′-OMe RNAs hatte. Das Protokoll kann mit Reagenzien aus dem TS-Kit und einem Reagenz aus dem “Nf”-Kit oder, um Geld zu sparen, mit hausgemachten Reagenzien, mit gleicher Leistung befolgt werden. Wir bieten auch ein detailliertes Protokoll für die Reinigung von sRNA aus der gesamten RNA und die Herstellung von präadenylierten 3’ Adapter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Vorbereitung der kleinen RNA-Bibliothek bleibt aufgrund von Verzerrungen schwierig, die hauptsächlich während der Adapterligationsschritte eingeführt werden. RNAs mit einer 2′-OMe-Modifikation an ihrem 3′-Ende wie pflanzliche miRNAs, piRNA bei Insekten, Nematoden und Säugetieren und kleine störende RNAs (siRNA) in Insekten und Pflanzen sind besonders schwer zu untersuchen, da die 2′-OMe-Modifikation 3′ Adapterligation hemmt. Eine Reihe von Lösungen wurden in der Literatur vorgeschlagen, um sRNA-Bibliotheksvorbe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Center for Scientific Research (CNRS), der Französischen Kommission für alternative Energien und Atomenergie (CEA) und der Universität Paris-Sud unterstützt. Alle Bibliotheksvorbereitungs-, Illumina-Sequenzierungs- und Bioinformatik-Analysen für diese Studie wurden in der I2BC Next-Generation Sequencing (NGS)-Anlage durchgeführt. Die Mitglieder der I2BC NGS-Einrichtung werden für die kritische Lektüre des Manuskripts und hilfreiche Vorschläge gewürdigt.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes |
References
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