Nous présentons un protocole détaillé de réparation de petite bibliothèque d'ARN avec moins de biais que les méthodes standard et une sensibilité accrue pour les ARN 2'-O-méthyle. Ce protocole peut être suivi à l'aide de réactifs faits maison pour économiser des coûts ou en utilisant des kits pour plus de commodité.
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Article de méthode
Améliorer l'ARN-seq : moins de biais et une meilleure détection des ARN 2'-O-Methyl
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'étude des petits ARN (ARN) par séquençage de la prochaine génération (NGS) est remise en question par des problèmes de partialité pendant la préparation de la bibliothèque. Plusieurs types d'ARNde tels que les microARN végétaux (miARN) portent une modification de 2'-O-méthyle (2'-OMe) à leur nucléotide terminal de 3'. Cette modification ajoute une autre difficulté car elle inhibe la ligature de l'adaptateur de 3'. Nous avons déjà démontré que les versions modifiées du protocole 'TruSeq (TS)' ont moins de biais et une meilleure détection des ARN 2'-OMe. Ici, nous décrivons en détail le protocole 'TS5', qui a montré la meilleure performance globale. TS5 peut être suivi soit à l'aide de réactifs faits maison ou de réactifs du kit TS, avec des performances égales.
Introduction
Les petits ARN (ARN) sont impliqués dans le contrôle d'une diversité de processus biologiques1. Les ARS réglementaires eucaryotes ont généralement entre 20 et 30 nt de taille; les trois principaux types sont les microARN (miRNA), les ARN piwi-interacting (piRNA) et les petits ARN interférant (siRNA). Les niveaux aberrants d'expression de miRNA ont été impliqués dans une série de maladies2. Cela souligne l'importance des miARN dans les domaines de la santé et des maladies et l'exigence d'outils de recherche précis et quantitatifs pour détecter les ARS en général.
Le séquençage de nouvelle génér....
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Protocole
1. Isolement des petits ARN
- Extraire l'ARN total à l'aide de réactifs à base de phénol ou de toute autre méthode. Vérifier si l'ARN est de bonne qualité.
- Pré-exécuter un gel TBE-urée de 15 % (voir Tableau des matériaux) pendant 15 min à 200 V.
- Pendant que le gel est pré-fonctionnement, mélangez 5-20 g d'ARN total dans un volume de 5-15 L avec un volume égal de colorant de chargement de formamide (voir Tableau des matériaux; formamide déionisé à 95 %, 0,025 % bleu bromophénol, 0,025 % de cyanol xylène, 5 mM EDTA pH 8) dans un tube PCR de 200 lL. De même, mélanger 10 l (200 ng) d'échelle à petit ARN (voir
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Résultats
Les étapes critiques sont l'isolement de la petite fraction d'ARN du matériel d'ARN total de départ (figure 3) et le produit final de la bibliothèque souhaité (figure 4). Les deux étapes impliquent la purification de gel de polyacrylamide ; le petit ARN est isolé des gels d'urée de TBE de 15%, tandis que les bibliothèques finales sont isolées des gels tBE indigènes de 6%. Le petit ARN isolé du gel peut être analysé sur une petite puce d'électrophoresis capillair.......
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Discussion
La préparation de la petite bibliothèque d'ARN demeure difficile en raison du biais, principalement introduit pendant les étapes de ligature d'adaptateur. Les ARN avec une modification de 2'-OMe à leur extrémité de 3' tels que les miARN de plante, le piRNA dans les insectes, les nématodes et les mammifères, et les petits ARN interférant (siRNA) dans les insectes et les usines sont particulièrement difficiles à étudier parce que la modification de 2'-OMe inhibe la ligature d'adaptateur de 3' Un certain nombre de solutions.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Ces travaux ont été soutenus par le Centre national de la recherche scientifique (CNRS), la Commission Français des énergies alternatives et de l'énergie atomique (CEA) et l'Université Paris-Sud. Toutes les analyses de préparation de la bibliothèque, de séquençage de l'illumine et de bioinformatique pour cette étude ont été effectuées à l'installation de séquençage de nouvelle génération (NGS) de l'I2BC. Les membres de l'installation I2BC NGS sont reconnus pour la lecture critique du manuscrit et des suggestions utiles.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 2100 Instrument de bioanalyseur ; | Agilent | G2939BA | |
| Acide-Phénol :Chloroforme, pH 4,5 (avec IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adénosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP billes | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyseur Kit ADN haute sensibilité | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyseur Petit Kit ARN | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X Filtres à tube | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminateur | divers suppiers | ||
| Kit PCR HotStart, avec dNTP | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex petit RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | gels |
| optionnels Novex TBE 6 % | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE gels d’urée 15 % | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen ; | 28304 | |
| Qubit 4 Kit de démarrage de quantification | ThermoFisher | Q33227 | |
| Kit de dosage de l’ADNss Qubit | ThermoFisher | Q10212 | |
| Colorant de chargement de gel d’ARN (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| Colorant de chargement de gel d’ARN (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| Inhibiteur de RNase, murin. | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Transcriptase inverse | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, tronqué | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp ADN échelle | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | option |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR petite échelle d’ARN | Zymo Research | R1090 | |
| les deux derniers chiffres correspondent à l’ensemble des indices |
Références
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8
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