排ビボ移行システムにおけるリンパ球移動の評価
Summary
このプロトコルでは、リンパ球は、多孔質膜によって下部チャンバから分離された移行系の上部チャンバーに配置される。ケモカインは底室に添加され、ケモカイン勾配に沿って活発な移動を誘導する。48時間後、リンパ球は、移行を定量するために両方の部屋でカウントされます。
Abstract
本明細書では、基本的な実験室のスキルと材料を用いて、排外移動系におけるリンパ球ケモキネティック運動を評価する効率的な方法を提示する。グループ2自然リンパ球細胞(ILC2)およびCD4+Tヘルパー細胞を、鶏卵オブアルブミン(OVA)チャレンジBALB/cマウスの脾臓および肺から単離した。CD4+T細胞とILC2の両方でCCR4の発現を比較的確認した。CCL17 および CCL22 は CCR4 の既知のリガンドです。そこで、このex vivo移行法を用いて、CCCL17-およびCCL22誘発性CCR4+リンパ球の動きを調べた。ケモカイン勾配を確立するために、CCL17およびCCL22を移行システムの底室に配置した。その後、単離されたリンパ球を上のチャンバーに加え、48時間の期間にわたって、リンパ球は3μmの細孔を通って下部チャンバーのケモカインに向かって積極的に移行した。これは、リンパ球の化学化物を決定するための効果的なシステムですが、当然のことながら、生体内臓器微小環境に見られる複雑さを模倣しません。これは、研究中の臓器およびリンパ球のその中の画像化の添加によって克服することができる方法の1つの制限である。対照的に、この方法の利点は、ライブイメージングよりもはるかに費用対効果の高い速度でエントリーレベルの技術者によって行う場合です。治療化合物が移行を増強するために利用可能になるにつれて、腫瘍浸潤細胞細胞の場合のように、または移行を阻害するために、おそらく免疫病理学が懸念される自己免疫疾患の場合には、スクリーニングツール。一般に、この方法は、目的のケモカインが一貫してメディア制御よりも統計的に高いレベルでケモキネティクスを生成している場合に有効である。このような場合、所定の化合物による阻害/増強の程度も同様に決定することができる。
Introduction
このオリジナルの移行方法は、実験医学1のジャーナルで1962年にスティーブン・ボイデンによって提示されました。ケモタキシスとケモキネティクスについて私たちが知っていることの多くは、ボイデン室の開発なしには不可能です。1977年に最初のケモカインが発見される前に、好中球1、2の細胞運動を増幅しながらマクロファージの細胞運動を停止させることができる血清因子について学ぶために、ex vivo移行システムが使用された。免疫細胞の移動に関する膨大な知識が開発され、現在までに47のケモカインが19の対応する受容体3、4で発見されています。さらに、これらのケモカイン経路の多数の阻害剤/増強剤は、治療目的5、6、7、8の開発を受けている。これらの化合物の多くは、与えられたケモカイン9に対する化合物と免疫細胞応答性との間の直接的な相互作用を理解するために同様の移行室で試験されている。
転移、または糖尿病は、炎症を起こした組織への、明確な感染10、11に対する健康的な炎症反応に不可欠なプロセスである。ボイデン室、移動システム、またはトランスウェル装置は、一般に多孔質膜1、12によって分離された2つのチャンバーから構成される。下部チャンバーは、最も頻繁に目的のケモカインを含む媒体を保持し、一方、白血病は上部のチャンバーに配置されます。膜中の細孔の大きさは、目的の細胞の大きさに基づいて選択することができる。このプロジェクトでは、リンパ球細胞の大きさが7~20μmの3μmの多孔質膜を細胞開発の段階に応じて選択しました。この細孔の大きさは、これらの細胞が受動的に細孔を通って落ちていないことを保証するが、彼らは積極的にケモカイン勾配に応答して移動していることを保証します。
このプロトコルの主な利点は、その費用対効果です。生体内移住では、動物の取り扱いや手術に関する広範な訓練が必要であり、研究者が常に利用できるわけではない高出力顕微鏡検査が必要な場合が多いため、移住は困難です。トランスマイグレーションを増強または阻害すると考えられる化合物の費用対効果の高いスクリーニングは、生体内イメージングの前に達成することができる。移行システムが厳密に制御されているので、細胞は最初にトランスウェル装置に加え、またはその逆に、ケモカイン阻害剤で最初に処理し、次いでトランスウェル装置に添加された細胞を治療してもよい。最後に、内皮細胞および/または地下膜タンパク質は、ケモキネティクスにおけるこれらのバリア細胞の関与を理解するために、トランスウェルインサートの1〜2日前にトランスウェルインサートの底部に添加することができる。繰り返しますが、システムのこれらの操作は、生体内研究のより複雑な前に、特定の化合物の有効性に関する重要な情報を決定する強力な手段を提供します。
転移室システムを利用することは、インビボおよびインビトロ条件12、13、14の様々な下でリンパ球移動性を評価する効果的な方法である。ここで、我々は、移民室内におけるケモカインに対する外生生リンパ球応答性を評価するための最適化された方法について説明する。この実験の例では、CD4+T細胞およびグループ2の自然リンパ球細胞(ILC2)を、雄および雌から単離し、BALB/cマウスをOVA-アレルゲン曝露後に分離した。アレルゲンチャレンジマウス由来のCCR4+CD45+リネージュ-(LIN-)ILC2がCCR4+CD4+Tヘルパー細胞よりもCCL17およびCCL22に向かってより効率的に移行するという仮説が生成された。 CCL17およびCCL22は、M2(アレルギー性)表現型の樹状細胞およびマクロファージによって一般的に産生されるケモカインであり、他の細胞の中でも、アレルギー15、16において。CCL17およびCCL22は、気道悪化16、17、18の間に肺で容易に検出されるので、アレルギー性炎症のバイオマーカーと考えることができる。重要なことに、CCR4発現は未処理の対照と比較して上昇し、ハウスダストダニ処理動物から単離されたILC2から生成されたバイオインフォマティクスデータ、および同様にIL-33でex vivoを処理したナイーブ動物からのILC2(IL-33()アレルゲン促進生殖細胞カイン)は、CCR419、20をアップレギュレートします。さらに、免疫ゲノムプロジェクトデータベース(www.immgen.org)におけるILC2のデータによれば、CCR4 mRNAはこれらの自然免疫細胞において高く発現される。現在までに、ILC2の組織への人身売買に関してはほとんど知られていないが、ILC2およびCD4+T細胞は、同様の転写因子および受容体を発現する化学タキシスおよびケモキチン学に類似したケモカインおよび受容体を使用する可能性が高い。そこで、ILC2とCD4+Tリンパ球のCCL17対CCL22応答性を、雄と雌の両方から、OVAチャレンジ動物と比較した。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書では、排生体移行システムにおけるケモカイン誘発リンパ球の移行を評価するための確立された方法を提示する。プロトコルにはいくつかの重要なステップがあり、そのうちの1つは実験中の免疫細胞上の正しいケモカイン受容体の発現を検証することである。私たちの手の中で、我々はアレルギー性炎症におけるTh2ヘルパーT細胞上のCCR4の重要性を強調する文献の体のためですCCR4を…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、米国肺協会(K.J.W.)、T.A.W.とK.J.W.に授与されたメモリアルユージーン・ケニー基金、ユタ大学からの寛大なスタートアップ支援、およびT.A.W.(VA I01BX0035)に対する退役軍人省賞によって資金提供されました。T.A.W.は退役軍人省から研究キャリアサイエンティスト賞(IK6 BX003781)を受賞しています。著者たちは、リサ・チュドメルカ氏の編集支援を認めたいと考えています。著者らは、この原稿のために生成されたフローサイトメトリーデータを収集する上での彼らのサポートのためのUNMCフローサイトメトリーコアに感謝します。
Materials
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 15250061 | |
| 1 mL syringe | BD Bioscience | 329424 | U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2" 1cc |
| 100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Dilute to 1x in RPMI media |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | polypropylene tubes |
| 3 um transwell inserts | Genesee Scientific | 25-288 | 24-well plate containing 12 transwell inserts |
| 3x stabilizing fixative | BD Pharmigen | 338036 | Prepare 1x solution according to manufacturers protocol |
| 5 mL polystyrene tubes | STEM Cell Technologies | 38007 | |
| 50 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-106 | polypropylene tubes |
| 8-chamber easy separation magnet | STEM Cell Technologies | 18103 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies Corporation | A1049201 | |
| Advanced cell strainer, 40 um | Genesee Scientific | 25-375 | nylon mesh, 40 micron strainers |
| Aluminum Hydroxide, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 239186-25G | 20 mg/mL |
| anti- mouse CCR4; APC-conjugated | Biolegend | 131211 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen | 557396 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 | Thermo-Fischer Scientific | 61-0114-82 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD16/32, Fc block | BD Pharmigen | 553141 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated | Thermo-Fischer Scientific | 47-0193-82 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated | BD Pharmigen | 552774 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD45; PE conjugated | BD Pharmigen | 56087 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse ICOS (CD278) | BD Pharmigen | 564070 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated | BD Pharmigen | 553164 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated | Biolegend | 145311 | 0.5 ug/test |
| Automated Cell Counter | BIORAD | 1450102 | |
| Automated Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | A2153-10G | 0.5% in serum-free RPMI |
| Cell Counter Clides | BIORAD | 1450015 | |
| Chicken Egg Ovalbumin, Grade V | Sigma-Aldrich | A5503-10G | 500 ug/mL |
| Collagenase, Type 1, Filtered | Worthington Biochemical Corporation | CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) | 25 U/mL in RPMI |
| compensation beads | Affymetrix | 01-1111-41 | 1 drop per contol tube |
| Dissociation Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-335 | |
| FACS Buffer | BD Pharmigen | 554657 | 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C |
| Heat Inactivated-FBS | Genesee Scientific | 25-525H | 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media |
| mouse CCL17 | GenScript | Z02954-20 | 50 ng/mL |
| mouse CCL22 | GenScript | Z02856-20 | 50 ng/mL |
| mouse CD4+ T cell enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19852 | |
| mouse IL-2 | GenScript | Z02764-20 | 20 ng/mL |
| mouse ILC2 enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19842 | |
| mouse recombinant IL-33 | STEM Cell Technologies | 78044 | 20 ng/mL |
| RPMI | Life Technologies Corporation | 22400071 | |
| Separation Buffer | STEM Cell Technologies | 20144 | 1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C |
| small animal nebulizer and chamber | Data Sciences International | ||
| sterile saline | Baxter | 2F7124; NDC 0338-0048-04 | 0.9% Sodium Chloride |
References
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