Avaliação da migração do linfócito em um sistema de transmigração ex vivo
Summary
Neste protocolo, os linfócitos são colocados na câmara superior de um sistema de transmigração, separados da câmara inferior por uma membrana porosa. A quimiocina é adicionada à câmara inferior, o que induz a migração ativa ao longo de um gradiente de quimiocina. Após 48 h, os linfócitos são contados em ambas as câmaras para quantificar o transmigration.
Abstract
Neste documento, apresentamos um método eficiente que pode ser executado com habilidades e materiais laboratoriais básicos para avaliar o movimento quimiocineítico do linfócito em um sistema de transmigração ex vivo. As pilhas lymphoid inata do grupo 2 (ILC2) e as pilhas do ajudante de CD4+ T foram isoladas dos baços e dos pulmões do ovalbumina do ovo da galinha (óvulos)-desafiaram ratos de Balb/c. Nós confirmamos a expressão de CCR4 em pilhas de T CD4+ e em ILC2, comparativamente. CCL17 e CCL22 são os ligantes conhecidos para CCR4; Conseqüentemente, usando este método ex vivo da transmigração nós examinamos o movimento CCL17– e CCL22-INDUCED de CCR4+ linfócitos. Para estabelecer gradientes de quimiocina, CCL17 e CCL22 foram colocados na câmara inferior do sistema de transmigração. Os linfócitos isolados foram adicionados então às câmaras superiores e sobre um período de 48 h os linfócitos migraram ativamente através dos poros de 3 μm para o quimiocina na câmara inferior. Este é um sistema eficaz para determinar o chemokinetics dos linfócitos, mas, compreensivelmente, não imitam as complexidades encontradas nos microambientes in vivo do órgão. Esta é uma limitação do método que pode ser superado pela adição da imagem latente in situ do órgão e dos linfócitos o estudo. Por outro lado, a vantagem deste método é que é pode ser realizada por um técnico de nível de entrada a uma taxa muito mais rentável do que imagens ao vivo. Como os compostos terapêuticos tornam-se disponíveis para melhorar a migração, como no caso de tumor infiltrando células imunes citotóxicas, ou para inibir a migração, talvez no caso de doenças auto-imunes onde a Imunopatologia é preocupante, este método pode ser usado como um ferramenta de triagem. Em geral, o método é eficaz se a quimiocina de interesse é consistentemente gerando quimiocinetics em um nível estatisticamente mais elevado do que o controle de mídia. Em tais casos, o grau de inibição/realce por um composto dado pode ser determinado também.
Introduction
Este método original de transmigração foi apresentado por Stephen Boyden em 1962 no periódico de medicina experimental1. Muito do que sabemos sobre quimiotaxia e quimiocinetics não seria possível sem o desenvolvimento da câmara de Boyden. Antes da descoberta da primeira quimiocina em 1977, os sistemas de transmigração ex vivo foram utilizados para aprender sobre os fatores séricos que poderiam prender o movimento celular em macrófagos, enquanto amplificavam a motilidade celular em neutrófilos1,2. Uma riqueza maciça do conhecimento foi desenvolvida a respeito da migração imune da pilha, e até à data, 47 quimiocinas foram descobertas agora com 19 receptores correspondentes3,4. Além disso, multidões de inibidores/potenciadores dessas vias de quimiocina passaram por desenvolvimento para fins terapêuticos5,6,7,8. Muitos desses compostos foram testados em câmaras de transmigração semelhantes para compreender as interações diretas entre os compostos e a responsividade da célula imune a uma determinada quimiocina9.
A transmigração, ou diapedese, em tecido inflamado é um processo essencial para uma resposta inflamatória saudável à infecção clara10,11. Uma câmara de Boyden, sistema de transmigração, ou aparelho transwell são geralmente compostas por duas câmaras separadas por uma membrana porosa1,12. A câmara inferior mais frequentemente detém meios contendo a quimiocina de interesse, enquanto os leucócitos são colocados na câmara superior. O tamanho do poro na membrana pode ser selecionado com base no tamanho da célula de interesse. Para este projeto, selecionamos uma membrana porosa de 3 μm, pois as células linfóides têm 7-20 μm de tamanho, dependendo do estágio do desenvolvimento celular. Este tamanho do poro assegura-se de que estas pilhas não estejam caindo passivamente através dos poros, mas que estão migrando ativamente em resposta ao inclinação do quimiocina.
A principal vantagem deste protocolo é a sua rentabilidade. A transmigração in vivo é difícil porque requer treinamento extensivo em manuseio e cirurgia de animais, e muitas vezes envolve microscopia de alta potência que nem sempre está disponível para um pesquisador. A triagem econômica de compostos pensados para aprimorar ou inibir a transmigração pode ser realizada com antecedência na imagem latente in vivo. Como o sistema de transmigração é rigorosamente controlado, as células podem ser tratadas inicialmente, em seguida, adicionadas ao aparelho transwell, ou, vice-versa, a quimiocina pode ser tratada primeiro com um inibidor de quimiocina, em seguida, as células adicionadas ao aparelho transwell. Por fim, células endoteliais e/ou proteínas da membrana basal podem ser adicionadas ao fundo da pastilha transwell 1-2 dias antes do experimento de transmigração para compreender o envolvimento dessas células de barreira em quimiocinetics. Novamente, essas manipulações do sistema fornecem um meio poderoso de determinar informações importantes sobre a eficácia de um determinado composto antes de estudos mais complicados in vivo.
A utilização de um sistema de câmara de transmigração é uma forma efetiva de avaliar a mobilidade dos linfócitos várias condições in vivo e in vitro12,13,14. Nisto, nós descrevemos um método aperfeiçoado para avaliar a compreensibilidade ex vivo do linfócito aos quimiocinas em uma câmara do transmigração. Neste experimento de exemplo, as células T CD4+ e as células linfóides inatas do grupo 2 (ILC2) foram isoladas de camundongos machos e fêmeas, Balb/c após exposição de óvulos-alérgeno. Uma hipótese foi gerada que CCR4+ CD45+ Lineage-(Lin-) ILC2 dos ratos alérgeno-desafiados migrariam mais EFICIENTEMENTE para CCL17 e CCL22 do que pilhas do ajudante de CCR4+ de CD4+ T. CCL17 e CCL22 são quimiocinas comumente produzidas por células dendríticas e macrófagos do fenótipo m2 (alérgico), entreoutrascélulas, emalergia15,16. CCL17 e CCL22 podem ser pensados como biomarcadores de inflamaçãoalérgica, poissão prontamente detectados nos pulmões durante as exacerbações das vias aéreas16,17,18. É importante ressaltar que a expressão CCR4 é elevada em comparação aos controles não tratados, como revelado em dados bioinformaticos gerados a partir de ILC2 isolados de animais tratados com ácaros da casa, e similarmente ILC2 de animais ingênuos tratados ex vivo com IL-33 ( cytokine inata de promoção do alérgeno) upregulates CCR4,19. Além disso, de acordo com dados para ILC2 na base de dados do projeto do genoma imunológico (www.immgen.org), CCR4 mRNA é expressado altamente nestas pilhas imunes inata. Até o momento, pouco se sabe sobre o tráfico de ILC2 em tecidos, mas é provável que as células T de ILC2 e CD4+ usem quimiocinas e receptores semelhantes para quimiotaxia e quimiocinetics, pois expressam fatores e receptores de transcrição semelhantes. Assim, comparamos a responsividade CCL17 versus CCL22, dos linfócitos T de ILC2 e CD4+ , tanto de machos como de fêmeas, animais desafiados por óvulos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nisto, nós apresentamos um método bem estabelecido para avaliar a migração chemokine-induzida dos linfócitos em um sistema ex vivo da transmigração. Existem várias etapas críticas no protocolo, sendo que a primeira é verificar a expressão do receptor de quimiocina correto nas células imunes no experimento. Em nossas mãos, nós escolhemos CCR4 por causa do corpo da literatura que destaca a importância de CCR4 em células T do ajudante Th2 na inflamação alérgica. A inflamação induzida por ovalbumina foi …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela American Lung Association (K.J.W.), o Memorial Eugene Kenney fundo concedido a T.A.W. e K.J.W., generoso apoio start-up da Universidade de Utah para K.J.W., e um departamento de assuntos veteranos prêmio de T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. é o destinatário de um prêmio de cientista de carreira de pesquisa (IK6 BX003781) do departamento de assuntos de veteranos. Os autores desejam reconhecer a assistência editorial da Sra. Lisa Chudomelka. Os autores agradecem o núcleo de citometria de fluxo da UNMC por seu apoio na coleta dos dados de citometria de fluxo gerados para este manuscrito.
Materials
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 15250061 | |
| 1 mL syringe | BD Bioscience | 329424 | U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2" 1cc |
| 100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Dilute to 1x in RPMI media |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | polypropylene tubes |
| 3 um transwell inserts | Genesee Scientific | 25-288 | 24-well plate containing 12 transwell inserts |
| 3x stabilizing fixative | BD Pharmigen | 338036 | Prepare 1x solution according to manufacturers protocol |
| 5 mL polystyrene tubes | STEM Cell Technologies | 38007 | |
| 50 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-106 | polypropylene tubes |
| 8-chamber easy separation magnet | STEM Cell Technologies | 18103 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies Corporation | A1049201 | |
| Advanced cell strainer, 40 um | Genesee Scientific | 25-375 | nylon mesh, 40 micron strainers |
| Aluminum Hydroxide, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 239186-25G | 20 mg/mL |
| anti- mouse CCR4; APC-conjugated | Biolegend | 131211 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen | 557396 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 | Thermo-Fischer Scientific | 61-0114-82 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD16/32, Fc block | BD Pharmigen | 553141 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated | Thermo-Fischer Scientific | 47-0193-82 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated | BD Pharmigen | 552774 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD45; PE conjugated | BD Pharmigen | 56087 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse ICOS (CD278) | BD Pharmigen | 564070 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated | BD Pharmigen | 553164 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated | Biolegend | 145311 | 0.5 ug/test |
| Automated Cell Counter | BIORAD | 1450102 | |
| Automated Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | A2153-10G | 0.5% in serum-free RPMI |
| Cell Counter Clides | BIORAD | 1450015 | |
| Chicken Egg Ovalbumin, Grade V | Sigma-Aldrich | A5503-10G | 500 ug/mL |
| Collagenase, Type 1, Filtered | Worthington Biochemical Corporation | CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) | 25 U/mL in RPMI |
| compensation beads | Affymetrix | 01-1111-41 | 1 drop per contol tube |
| Dissociation Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-335 | |
| FACS Buffer | BD Pharmigen | 554657 | 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C |
| Heat Inactivated-FBS | Genesee Scientific | 25-525H | 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media |
| mouse CCL17 | GenScript | Z02954-20 | 50 ng/mL |
| mouse CCL22 | GenScript | Z02856-20 | 50 ng/mL |
| mouse CD4+ T cell enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19852 | |
| mouse IL-2 | GenScript | Z02764-20 | 20 ng/mL |
| mouse ILC2 enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19842 | |
| mouse recombinant IL-33 | STEM Cell Technologies | 78044 | 20 ng/mL |
| RPMI | Life Technologies Corporation | 22400071 | |
| Separation Buffer | STEM Cell Technologies | 20144 | 1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C |
| small animal nebulizer and chamber | Data Sciences International | ||
| sterile saline | Baxter | 2F7124; NDC 0338-0048-04 | 0.9% Sodium Chloride |
References
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