تقييم هجرة الخلايا الليمفاوية في نظام الهجرة فيفو السابقين
Summary
في هذا البروتوكول ، يتم وضع الخلايا الليمفاوية في الغرفة العليا لنظام الهجرة ، مفصولة عن الغرفة السفلية بواسطة غشاء مسامي. يضاف Chemokine إلى الغرفة السفلى، مما يحفز الهجرة النشطة على طول التدرج chemokine. بعد 48 ساعة، يتم حساب الخلايا الليمفاوية في كلتا الغرفتين لتكميم الهجرة.
Abstract
هنا، نقدم طريقة فعالة التي يمكن تنفيذها مع المهارات المختبرية الأساسية والمواد لتقييم الحركة الكيميائية للخلايا الليمفاوية في نظام الهجرة عبر الجسم الحي السابق. تم عزل الخلايا اللمفاوية الفطرية للمجموعة 2 (ILC2) وCD4+ T الخلايا المساعدة من الطحال والرئتين من الفئران التي تواجه بيضة الدجاج (OVA) التي تواجه تحديات BALB/c. وأكدنا التعبير عن CCR4 على كل من CD4+ T الخلايا وILC2، نسبيا. CCL17 و CCL22 هي الأربطة المعروفة لCCR4; لذلك، باستخدام هذه الطريقة الهجرة الجسم الحي السابق فحصنا CCL17– وCCL22 الناجمة عن الحركة من CCR4+ الخلايا الليمفاوية. ولإنشاء تدرجات كيميائية، وُضع كل من CCL17 وCCL22 في الغرفة السفلى لنظام الهجرة العابرة. ثم أضيفت الخلايا الليمفاوية المعزولة إلى الغرف العليا وعلى مدى فترة 48 ح هاجر الخلايا الليمفاوية بنشاط من خلال المسام 3 ميكرومتر نحو chemokine في الغرفة السفلى. هذا هو نظام فعال لتحديد الحركة الكيميائية للخلايا الليمفاوية، ولكن، من المفهوم، لا يحاكي التعقيدات الموجودة في البيئات الدقيقة للأعضاء في الجسم الحي. هذا هو أحد القيود على الطريقة التي يمكن التغلب عليها عن طريق إضافة التصوير في الموقع من الجهاز والخلايا الليمفاوية قيد الدراسة. وعلى النقيض من ذلك، فإن ميزة هذه الطريقة هي أنه يمكن أن يقوم بها فني مبتدئ بمعدل أكثر فعالية من حيث التكلفة من التصوير الحي. كما تصبح المركبات العلاجية متاحة لتعزيز الهجرة، كما هو الحال في تسرب الورم الخلايا المناعية السامة للخلايا، أو لمنع الهجرة، وربما في حالة أمراض المناعة الذاتية حيث علم الأمراض المناعية هو مصدر قلق، ويمكن استخدام هذه الطريقة باعتبارها أداة الفرز. بشكل عام، فإن الطريقة فعالة إذا كان chemokine من الفائدة هو توليد باستمرار الحركية الكيميائية على مستوى أعلى إحصائيا من السيطرة على وسائل الإعلام. وفي مثل هذه الحالات، يمكن تحديد درجة التثبيط/التعزيز من قبل مركب معين أيضاً.
Introduction
وقدم هذا الأسلوب الأصلي الهجرة من قبل ستيفن بويدن في عام 1962 في مجلة الطب التجريبي1. الكثير مما نعرفه عن الأدوية الكيميائية والحركية الكيميائية لن يكون ممكناً بدون تطوير غرفة بويدن. قبل اكتشاف أول chemokine في عام 1977، تم استخدام أنظمة الهجرة خارج الجسم الحي لمعرفة المزيد عن العوامل المصل التي يمكن أن توقف الحركة الخلوية في الضامة في حين تضخيم الحركة الخلوية في العدلات1،2. وقد وضعت ثروة هائلة من المعرفة فيما يتعلق بهجرة الخلايا المناعية، وحتى الآن، تم اكتشاف 47 chemokines الآن مع 19 مستقبلات المقابلة3،4. وبالإضافة إلى ذلك، شهدت العديد من مثبطات / محسنات هذه المسارات chemokine التنمية لأغراض علاجية5،6،7،8. وقد تم اختبار العديد من هذه المركبات في غرف الهجرة مماثلة لفهم التفاعلات المباشرة بين المركبات واستجابة الخلايا المناعية لchemokine معين9.
الهجرة، أو التبذير، إلى الأنسجة الملتهبة هي عملية أساسية لاستجابة التهابية صحية لإزالة العدوى10،11. غرفة Boyden، نظام الهجرة، أو جهاز transwell تتكون عموما من غرفتين مفصولة غشاء مسامية1،12. الغرفة السفلى في معظم الأحيان يحمل وسائل الإعلام التي تحتوي على chemokine من الفائدة، في حين يتم وضع الكريات البيض في الغرفة العليا. يمكن اختيار حجم المسام في الغشاء على أساس حجم خلية الفائدة. لهذا المشروع، اخترنا غشاء مسامية 3 ميكرومتر، كما الخلايا اللمفاوية هي 7-20 ميكرومتر في الحجم، اعتمادا على مرحلة التطور الخلوي. هذا الحجم المسام يضمن أن هذه الخلايا لا تسقط بشكل سلبي من خلال المسام، ولكن أنها تهاجر بنشاط استجابة للتدرج chemokine.
والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي فعاليته من حيث التكلفة. في نقل الجسم الحي أمر صعب لأنه يتطلب تدريبا مكثفا في التعامل مع الحيوانات والجراحة، وغالبا ما ينطوي على الفحص المجهري عالية الطاقة التي ليست متاحة دائما للباحث. ويمكن إجراء فحص فعال من حيث التكلفة للمركبات التي يعتقد أنها تعزز أو تمنع الهجرة إلى الخارج قبل التصوير في الجسم الحي. لأن نظام الهجرة إلى الخارج يتم التحكم فيه بإحكام، يمكن علاج الخلايا في البداية ثم إضافتها إلى جهاز ترانسويل، أو العكس بالعكس، يمكن علاج chemokine أولا مع مثبط chemokine ثم الخلايا المضافة إلى جهاز transwell. وأخيرا، يمكن إضافة الخلايا البطانية و / أو بروتينات غشاء الطابق السفلي إلى الجزء السفلي من transwell إدراج 1-2 أيام قبل تجربة الهجرة لفهم مشاركة هذه الخلايا الحاجزة في الحركية الكيميائية. مرة أخرى، هذه التلاعبات في النظام توفر وسيلة قوية لتحديد المعلومات الهامة حول فعالية مركب معين قبل أكثر تعقيدا في الدراسات الحية.
استخدام نظام غرفة الهجرة هو وسيلة فعالة لتقييم حركة الخلايا الليمفاوية في ظل مختلف في الظروف الحية والمختبرية12،13،14. هنا، ونحن نصف طريقة الأمثل لتقييم استجابة الخلايا الليمفاوية في الجسم الحي السابق لchemokines في غرفة الهجرة. في هذه التجربة المثال، تم عزل خلايا CD4+ T والخلايا اللمفاوية الفطرية المجموعة 2 (ILC2) من الذكور والإناث، والفئران BALB /c بعد التعرض OVA-مسببات الحساسية. تم إنشاء فرضية أن CCR4+ CD45+ النسب – (LIN-) ILC2 من الفئران التي تواجه مسببات الحساسية سوف تهاجر بشكل أكثر كفاءة نحو CCL17 و CCL22 من CCR4+ CD4+ T الخلايا المساعد. CCL17 و CCL22 هي chemokines تنتج عادة من قبل الخلايا الجذعية والضامة من النمط الظاهري M2 (حساسية)، من بين خلايا أخرى، في الحساسية15،16. يمكن اعتبار CCL17 و CCL22 علامات حيوية لالتهاب الحساسية حيث يتم اكتشافها بسهولة في الرئتين أثناء تفاقم مجرى الهواء16و17و18. الأهم من ذلك، يتم رفع التعبير CCR4 بالمقارنة مع الضوابط غير المعالجة، كما هو الحال في بيانات المعلوماتية الحيوية التي تم إنشاؤها من ILC2 معزولة من الحيوانات المعالجة عث الغبار المنزل، وبالمثل ILC2 من الحيوانات السذاجة تعامل في الجسم الحي السابق مع IL-33 ( [قبرص CCR444] 19،20. وعلاوة على ذلك، وفقا لبيانات ILC2 في قاعدة بيانات مشروع الجينوم المناعي (www.immgen.org)، يتم التعبير عن CCR4 mRNA بشكل كبير في هذه الخلايا المناعية الفطرية. وحتى الآن، لا يُعرف سوى القليل فيما يتعلق بالاتجار بـ ILC2 في الأنسجة، ولكن من المرجح أن تستخدم خلايا ILC2 وCD4+ T خلايا chemokines ومستقبلات مماثلة للأجهزة الكيميائية والحركية الكيميائية لأنها تعبر عن عوامل النسخ والمستقبلات المماثلة. وهكذا، قارنا CCL17 مقابل استجابة CCL22، من ILC2 و CD4+ الخلايا الليمفاوية T، من كل من الذكور والإناث، والحيوانات التي تواجه تحديا OVA.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نقدم طريقة راسخة لتقييم الهجرة الناجمة عن chemokine من الخلايا الليمفاوية في نظام الهجرة في الجسم الحي السابق. هناك عدة خطوات حاسمة في البروتوكول، أولها التحقق من التعبير عن مستقبلات chemokine الصحيح على الخلايا المناعية في التجربة. في أيدينا، اخترنا CCR4 بسبب الجسم من الأدب الذي يسلط الضوء عل?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل جمعية الرئة الأمريكية (K.J.W.)، وصندوق يوجين كيني التذكاري الذي منح لT.A.W. وK.J.W.، والدعم السخي لبدء من جامعة يوتا لK.J.W.، وجائزة وزارة شؤون المحاربين القدماء إلى T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. هو حاصل على جائزة عالم مهنة البحوث (IK6 BX003781) من وزارة شؤون المحاربين القدماء. ويود صاحبا البلاغ أن ينوه بالمساعدة التحريرية التي تقدمها السيدة ليزا تشودوميلكا. ويشكر المؤلفون نواة قياس التدفق في اللجنة على دعمهم في جمع بيانات قياس التدفق السيتومتري ة التي تم إنشاؤها لهذه المخطوطة.
Materials
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 15250061 | |
| 1 mL syringe | BD Bioscience | 329424 | U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2" 1cc |
| 100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Dilute to 1x in RPMI media |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | polypropylene tubes |
| 3 um transwell inserts | Genesee Scientific | 25-288 | 24-well plate containing 12 transwell inserts |
| 3x stabilizing fixative | BD Pharmigen | 338036 | Prepare 1x solution according to manufacturers protocol |
| 5 mL polystyrene tubes | STEM Cell Technologies | 38007 | |
| 50 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-106 | polypropylene tubes |
| 8-chamber easy separation magnet | STEM Cell Technologies | 18103 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies Corporation | A1049201 | |
| Advanced cell strainer, 40 um | Genesee Scientific | 25-375 | nylon mesh, 40 micron strainers |
| Aluminum Hydroxide, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 239186-25G | 20 mg/mL |
| anti- mouse CCR4; APC-conjugated | Biolegend | 131211 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen | 557396 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 | Thermo-Fischer Scientific | 61-0114-82 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD16/32, Fc block | BD Pharmigen | 553141 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated | Thermo-Fischer Scientific | 47-0193-82 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated | BD Pharmigen | 552774 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD45; PE conjugated | BD Pharmigen | 56087 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse ICOS (CD278) | BD Pharmigen | 564070 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated | BD Pharmigen | 553164 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated | Biolegend | 145311 | 0.5 ug/test |
| Automated Cell Counter | BIORAD | 1450102 | |
| Automated Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | A2153-10G | 0.5% in serum-free RPMI |
| Cell Counter Clides | BIORAD | 1450015 | |
| Chicken Egg Ovalbumin, Grade V | Sigma-Aldrich | A5503-10G | 500 ug/mL |
| Collagenase, Type 1, Filtered | Worthington Biochemical Corporation | CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) | 25 U/mL in RPMI |
| compensation beads | Affymetrix | 01-1111-41 | 1 drop per contol tube |
| Dissociation Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-335 | |
| FACS Buffer | BD Pharmigen | 554657 | 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C |
| Heat Inactivated-FBS | Genesee Scientific | 25-525H | 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media |
| mouse CCL17 | GenScript | Z02954-20 | 50 ng/mL |
| mouse CCL22 | GenScript | Z02856-20 | 50 ng/mL |
| mouse CD4+ T cell enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19852 | |
| mouse IL-2 | GenScript | Z02764-20 | 20 ng/mL |
| mouse ILC2 enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19842 | |
| mouse recombinant IL-33 | STEM Cell Technologies | 78044 | 20 ng/mL |
| RPMI | Life Technologies Corporation | 22400071 | |
| Separation Buffer | STEM Cell Technologies | 20144 | 1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C |
| small animal nebulizer and chamber | Data Sciences International | ||
| sterile saline | Baxter | 2F7124; NDC 0338-0048-04 | 0.9% Sodium Chloride |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).
- Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
- Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
- Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).
- Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
- Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn’s and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).
- Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
- Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
- Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
- Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
- Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
- Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
- Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
- Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
- Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).
- Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
- Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
- Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).
- Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
- Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).
- Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
- Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
- Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
- Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
- Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
- Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
- Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
- Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
- Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).
