הערכה של הגירה לימפוציט במערכת הגירה לשעבר של Vivo
Summary
בפרוטוקול זה, לימפוציטים ממוקמים בחדר העליון של מערכת הגירה גלגול מופרדים מהתא התחתון על ידי קרום נקבובי. כימוקין מתווסף לחדר התחתון, אשר מעורר הגירה פעילה לאורך הדרגתי כימוקין. לאחר 48 h, לימפוציטים נספרים בשני התאים כדי הגירה טרנסטייט.
Abstract
בזאת, אנו מציגים שיטה יעילה שניתן לבצע עם מיומנויות מעבדה בסיסיות וחומרים להערכת התנועה לימפוציטים כימוקינטית במערכת vivo גלגול גירה לשעבר. קבוצה 2 מולדת תאים הלימפה (ILC2) ו CD4+ T מסייע תאים היו מבודדים טחולים והריאות של עוף ביצה אובלבומין (OVA)-מאותגרים balb/c עכברים. אנו אישר את הביטוי של CCR4 הן CD4+ T תאים ו ILC2, יחסית. CCL17 ו CCL22 הם ליגנדס ידועים עבור CCR4; לכן, שימוש זה לשעבר שיטה vivo גלגול גירה בדקנו CCL17– ו CCL22 המושרה תנועה של CCR4+ לימפוציטים. כדי ליצור מעברי כימוקין, CCL17 ו CCL22 הוצבו בחדר התחתון של מערכת ההגירה. לימפוציטים מבודדים נוספו אז ללשכה העליונה ובמשך תקופה של 48 h לימפוציטים באופן פעיל הועברו דרך 3 יקרומטר נקבוביות לעבר כימוקין בחדר התחתון. זוהי מערכת יעילה לקביעת כימוקינטיקה של לימפוציטים, אבל, באופן מובן, לא לחקות את המורכבויות שנמצאו ב vivo מיקרוסביבות העוגב. זוהי מגבלה אחת של השיטה שניתן להתגבר על ידי תוספת של הדמיה באתרו של האיבר ולימפוציטים תחת לימוד. לעומת זאת, היתרון של שיטה זו הוא שניתן לבצע על ידי טכנאי ברמת הכניסה בשיעור חסכוני הרבה יותר מאשר הדמיה חיה. כמו תרכובות טיפוליות להיות זמין כדי לשפר את ההגירה, כמו במקרה של הגידול תאים חיסוניים ציטוטוקסיים, או לעכב הגירה, אולי במקרה של מחלות אוטואימוניות שבו immunopathology הוא של דאגה, שיטה זו יכולה לשמש כ כלי ההקרנה. באופן כללי, השיטה יעילה אם כימוקין העניין מייצר בעקביות כימוקינטיקה ברמה גבוהה מבחינה סטטיסטית מאשר בקרת המדיה. במקרים כאלה, ניתן לקבוע גם את מידת העיכוב/השיפור של תרכובת נתונה.
Introduction
שיטת הגירה מקורית זו הוצגה על ידי סטיבן בוידן ב-1962 בכתב העת לרפואה ניסויית1. הרבה ממה שאנחנו יודעים על כימוטקסיס וכימוקינטיקה לא יהיה אפשרי ללא התפתחות של החדר Boyden. לפני הגילוי של כימוקין הראשון ב 1977, לשעבר vivo גלגול גירה מערכות שימשו כדי ללמוד על סרום-גורמים שיכולים לעצור את התנועה הסלולרית ב מקרופאגים תוך הגברה תנועתיות הסלולר ב נויטרופילים1,2. עושר רב של ידע פותחה לגבי הגירה התא החיסונית, ועד היום, 47 נוגדנים התגלו כעת עם 19 קולטנים תואמים3,4. בנוסף, המוני מעכבי/משפרי מסלולים אלה כימוקין עברו פיתוח למטרות טיפוליות5,6,7,8. רבים מן התרכובות הללו נבדקו בתאי הגירה דומים כדי להבין אינטראקציות ישירות בין תרכובות והיענות לתא החיסונית של כימוקין9.
הגירה, או דיאפאדזיס, לתוך רקמה דלקתית היא תהליך חיוני לתגובה דלקתית בריאה לזיהום ברור10,11. חדר boyden, מערכת גלגול גירה, או מכשירי העברת התקנים מורכבים בדרך כלל משני תאים מופרדים על ידי קרום נקבובי1,12. החדר התחתון מחזיק בדרך כלל מדיה המכילה את כימוקין של עניין, בעוד לוקיציטים ממוקמים בתא העליון. גודל הנקבובית בקרום ניתן לבחור בהתבסס על גודל התא של עניין. עבור פרוייקט זה, בחרנו 3 יקרומטר ממברנה נקבובי, כמו תאים הלימפה הם 7-20 יקרומטר בגודל, בהתאם לשלב של פיתוח הסלולר. זה גודל הנקבובית מבטיח כי תאים אלה אינם מתפרקים פסיבי דרך הנקבוביות, אבל הם באופן פעיל מעביר בתגובה הדרגתי כימוקין.
היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא יעילותו. ב vivo גלגול גירה קשה כי זה דורש הכשרה נרחבת בטיפול בעלי חיים וניתוח, ולעתים קרובות כרוך מיקרוסקופ רב עוצמה כי הוא לא תמיד זמין לחוקר. עלות הקרנה אפקטיבית של תרכובות חשב לשפר או לעכב הגירה יכול להתבצע מראש בהדמיה vivo. בגלל מערכת גלגול גירה נשלטת בחוזקה, תאים עשויים להיות מטופלים בתחילה ולאחר מכן הוסיף המנגנון גלגול או, להיפך, כימוקין יכול להיות מטופלים הראשון עם מעכב כימוקין ולאחר מכן תאים הוסיף המנגנון גלגול יטב. לבסוף, תאים אנדותל ו/או חלבונים קרום המרתף ניתן להוסיף לחלק התחתון של הכנס transwell 1-2 ימים לפני הניסוי transwell גירה כדי להבין את המעורבות של תאי המכשול האלה בתוך כימוקינטיקה. שוב, מניפולציות אלה של המערכת לספק אמצעי רב עוצמה לקביעת מידע חשוב על האפקטיביות של מתחם נתון מראש יותר מסובך במחקרים vivo.
ניצול מערכת קאמרית הגירה היא דרך יעילה להעריך את ניידות הימפוציטים תחת שונות בvivo ובתנאי מבחנה12,13,14. להלן, אנו מתארים שיטה ממוטבת להערכת תגובתיות vivo לימפוציט לשעבר לנוגדנים בחדר הגירה טרנסטראני. בדוגמה זו ניסוי, CD4+ T תאים וקבוצה 2 תאי הלימפה המולדת (ILC2) היו מבודדים מזכר ונקבה, balb/c עכברים בעקבות החשיפה לאלרגן. השערה נוצרה כי CCR4+ CD45+ שושלת היוחסין-(LIN-) ILC2 מעכברים מאותגרים לאלרגן יועברו ביעילות רבה יותר כלפי CCL17 וCCL22 מאשר CCR4+ CD4+ T מסייע תאים. CCL17 ו CCL22 הם נוגדנים המיוצר בדרך כלל על ידי תאים דנדריטים ומקרופאגים של M2 (אלרגית) פנוטיפ, בין תאים אחרים, ב אלרגיה15,16. CCL17 ו CCL22 יכול להיות מחושב כמו סמנים ביוארגטים של דלקת אלרגית כפי שהם מזוהים בקלות בריאות במהלך המשך הנשימה16,17,18. חשוב מכך, ביטוי CCR4 הוא גבוה בהשוואה לפקדים לא מטופלים, כפי שנחשף בנתונים bio, שנוצר מ ILC2 מבודד קרדית אבק הבית בעלי חיים מטופלים, ובדומה ILC2 מבעלי חיים תמימים מטופלים לשעבר vivo עם IL-33 ( אלרגן-קידום ציטוקין מולדים) upregulates CCR419,20. יתר על כן, על פי נתונים עבור ILC2 במסד הנתונים של הגנום האימונולוגיים (www.immgen.org), CCR4 mRNA מתבטאת במידה רבה אלה תאים חיסוניים מולדים. עד כה, מעט ידוע לגבי הסחר של ILC2 לתוך רקמות, אבל סביר להניח כי ILC2 ו CD4+ T תאים להשתמש בנוגדנים דומה וקולטנים עבור כימוטקאס וכימוקינטיקה כפי שהם מבטאים את גורמי התמלול דומים וקולטנים. כך, אנו השוונו CCL17 לעומת התגובה CCL22, של ILC2 ו CD4+ לימפוציטים, הן זכר ונקבה, בעלי חיים מאותגרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
להלן, אנו מציגים שיטה מבוססת היטב להערכת כימוקין המושרה הגירה של לימפוציטים במערכת vivo גלגול גירה לשעבר. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול, הראשון אשר מאמת את הביטוי של קולטן כימוקין הנכון על התאים החיסוניים בניסוי. בידינו, בחרנו CCR4 בגלל הגוף של ספרות המדגיש את החשיבות של CCR4 על Th2 תאים T מסיי…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו ממומנת על ידי האגודה האמריקאית לריאות (K.J.W.), הקרן יוג’ין קני הזיכרון הוענק T.A.W. ו K.J.W., התחלה נדיבה תמיכה מאוניברסיטת יוטה עבור K.J.W., ו המחלקה לענייני ותיקי לשנת הפרס T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. הוא המקבל של פרס מדען קריירה מחקר (IK6 BX003781) מהמחלקה לענייני ותיקי. המחברים רוצים להכיר בסיוע המערכת מגברת ליסה צ’דואלקה. המחברים מודים על הליבה UNMC זרימה Cy, לתמיכה שלהם באיסוף הזרימה cy, לנסות את הנתונים שנוצרו עבור כתב יד זה.
Materials
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 15250061 | |
| 1 mL syringe | BD Bioscience | 329424 | U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2" 1cc |
| 100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Dilute to 1x in RPMI media |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | polypropylene tubes |
| 3 um transwell inserts | Genesee Scientific | 25-288 | 24-well plate containing 12 transwell inserts |
| 3x stabilizing fixative | BD Pharmigen | 338036 | Prepare 1x solution according to manufacturers protocol |
| 5 mL polystyrene tubes | STEM Cell Technologies | 38007 | |
| 50 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-106 | polypropylene tubes |
| 8-chamber easy separation magnet | STEM Cell Technologies | 18103 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies Corporation | A1049201 | |
| Advanced cell strainer, 40 um | Genesee Scientific | 25-375 | nylon mesh, 40 micron strainers |
| Aluminum Hydroxide, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 239186-25G | 20 mg/mL |
| anti- mouse CCR4; APC-conjugated | Biolegend | 131211 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen | 557396 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 | Thermo-Fischer Scientific | 61-0114-82 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD16/32, Fc block | BD Pharmigen | 553141 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated | Thermo-Fischer Scientific | 47-0193-82 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated | BD Pharmigen | 552774 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD45; PE conjugated | BD Pharmigen | 56087 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse ICOS (CD278) | BD Pharmigen | 564070 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated | BD Pharmigen | 553164 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated | Biolegend | 145311 | 0.5 ug/test |
| Automated Cell Counter | BIORAD | 1450102 | |
| Automated Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | A2153-10G | 0.5% in serum-free RPMI |
| Cell Counter Clides | BIORAD | 1450015 | |
| Chicken Egg Ovalbumin, Grade V | Sigma-Aldrich | A5503-10G | 500 ug/mL |
| Collagenase, Type 1, Filtered | Worthington Biochemical Corporation | CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) | 25 U/mL in RPMI |
| compensation beads | Affymetrix | 01-1111-41 | 1 drop per contol tube |
| Dissociation Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-335 | |
| FACS Buffer | BD Pharmigen | 554657 | 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C |
| Heat Inactivated-FBS | Genesee Scientific | 25-525H | 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media |
| mouse CCL17 | GenScript | Z02954-20 | 50 ng/mL |
| mouse CCL22 | GenScript | Z02856-20 | 50 ng/mL |
| mouse CD4+ T cell enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19852 | |
| mouse IL-2 | GenScript | Z02764-20 | 20 ng/mL |
| mouse ILC2 enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19842 | |
| mouse recombinant IL-33 | STEM Cell Technologies | 78044 | 20 ng/mL |
| RPMI | Life Technologies Corporation | 22400071 | |
| Separation Buffer | STEM Cell Technologies | 20144 | 1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C |
| small animal nebulizer and chamber | Data Sciences International | ||
| sterile saline | Baxter | 2F7124; NDC 0338-0048-04 | 0.9% Sodium Chloride |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).
- Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
- Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
- Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).
- Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
- Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn’s and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).
- Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
- Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
- Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
- Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
- Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
- Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
- Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
- Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
- Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).
- Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
- Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
- Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).
- Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
- Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).
- Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
- Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
- Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
- Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
- Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
- Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
- Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
- Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
- Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).
