Summary

एक पूर्व Vivo प्रवास प्रणाली में लिम्फोसाइट प्रवास का आकलन

Published: September 20, 2019
doi:

Summary

इस प्रोटोकॉल में, लिम्फोसाइटों को स्थानांतरण प्रणाली के शीर्ष कक्ष में रखा जाता है, जो नीचे कक्ष से एक छिद्रयुक्त झिल्ली द्वारा अलग किया जाता है। Chemokine नीचे कक्ष में जोड़ा जाता है, जो एक chemokine ढाल के साथ सक्रिय प्रवास लाती है. 48 ज के बाद, लिम्फोसाइटों को दोनों कक्षों में माइग्रेशन की मात्रा निर्धारित करने के लिए गिना जाता है।

Abstract

इसमें, हम एक कुशल विधि है कि बुनियादी प्रयोगशाला कौशल और सामग्री के साथ निष्पादित किया जा सकता है एक पूर्व vivo प्रवास प्रणाली में लिम्फोसाइट chemokinetic आंदोलन का आकलन प्रस्तुत करते हैं. समूह 2 जन्मजात लसीकाभ कोशिकाओं (ILC2) और CD4+ टी सहायक कोशिकाओं तिल्ली और चिकन अंडे ovalbumin के फेफड़ों से अलग किया गया (OVA)-challenged BALB / हम दोनों CD4+ टी कोशिकाओं और ILC2, तुलनात्मक रूप से पर CCR4 की अभिव्यक्ति की पुष्टि की. CCL17 और CCL22 CCR4 के लिए जाना जाता ligands हैं; इसलिए, इस पूर्व vivo स्थानांतरण विधि का उपयोग कर हम CCL17 की जांच की और CCR22 प्रेरित आंदोलन CCR4+ लिम्फोसाइटों. रसायन ग्राडिएंट्स स्थापित करने के लिए सीसीएल17 और सीसीएल22 को स्थानांतरण प्रणाली के निचले कक्ष में रखा गया था। अलग लिम्फोसाइटों तो शीर्ष कक्षों में जोड़ा गया और एक 48 एच अवधि में लिम्फोसाइटों सक्रिय रूप से नीचे कक्ष में chemokine की ओर 3 m pores के माध्यम से चले गए. यह लिम्फोसाइटों के कीमोकिनेटिक्स का निर्धारण करने के लिए एक प्रभावी प्रणाली है, लेकिन, जाहिर है, विवो अंग माइक्रोएन्यूमेंट्स में पाए जाने वाले जटिलताओं की नकल नहीं करता है। यह विधि है कि अध्ययन के तहत अंग और लिम्फोसाइटों के situ इमेजिंग में जोड़ने के द्वारा दूर किया जा सकता है की एक सीमा है. इसके विपरीत, इस विधि का लाभ यह है कि लाइव इमेजिंग की तुलना में एक बहुत अधिक लागत प्रभावी दर पर एक प्रवेश स्तर तकनीशियन द्वारा किया जा सकता है. के रूप में चिकित्सकीय यौगिकों प्रवास को बढ़ाने के लिए उपलब्ध हो जाते हैं, के रूप में cytotoxic प्रतिरक्षा कोशिकाओं में घुसपैठ ट्यूमर के मामले में, या प्रवास को बाधित करने के लिए, शायद autoimmune रोगों के मामले में जहां इम्यूनोपैथोलॉजी चिंता का विषय है, इस विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है एक स्क्रीनिंग उपकरण. सामान्य में, विधि प्रभावी है अगर ब्याज की chemokine लगातार मीडिया नियंत्रण से एक सांख्यिकीय उच्च स्तर पर chemokinetics पैदा कर रहा है. ऐसे मामलों में, किसी दिए गए यौगिक द्वारा निषेध/संवर्धन की डिग्री के रूप में अच्छी तरह से निर्धारित किया जा सकता है।

Introduction

यह मूल स्थानांतरण विधि स्टीफन Boyden द्वारा 1962 में प्रयोगात्मक चिकित्साके जर्नल1में प्रस्तुत किया गया था . क्या हम chemotaxis और chemokinetics के बारे में पता है की बहुत Boyden कक्ष के विकास के बिना संभव नहीं होगा. 1977 में पहली chemokine की खोज से पहले, पूर्व vivo प्रवास प्रणालियों सीरम-कारकों कि मैक्रोफेज में सेलुलर आंदोलन को गिरफ्तार कर सकता है के बारे में जानने के लिए इस्तेमाल किया गया, जबकि न्यूट्रोफिल में सेलुलर गतिशीलता बढ़ाना1,2. प्रतिरक्षा कोशिका प्रवास के संबंध में ज्ञान का एक विशाल धन विकसित किया गया है, और आज तक, 47 chemokines अब 19 इसी रिसेप्टर्स3,4के साथ की खोज की गई है. इसके अतिरिक्त , इन चीमोकीन पथों के अवरोधकों/संवर्धनों की भीड़ चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए विकास कर चुकी है5,6,7,8. इनमें से अनेक यौगिकों का इसी प्रकार के स्थानांतरण कक्षों में परीक्षण किया गया है ताकि यौगिकों के बीच प्रत्यक्ष अन्योन्यक्रिया को समझा जा सके और किसी दी गई कीमोकिन9के प्रति प्रतिरक्षा कोशिका प्रतिक्रियाशीलता को समझा जा सके .

वाष्पित, या डायपेडेसिस, सूजन ऊतक में स्पष्ट संक्रमण10,11के लिए एक स्वस्थ भड़काऊ प्रतिक्रिया के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया है। बॉयडेन कक्ष, स्थानांतरण प्रणाली या ट्रांसवेल उपकरण सामान्यतः दो कक्षों से बना होता है जो छिद्रयुक्त झिल्ली1,12से अलग होते हैं . नीचे कक्ष सबसे अधिक बार ब्याज की chemokine युक्त मीडिया रखती है, जबकि ल्यूकोसाइट्स शीर्ष कक्ष में रखा जाता है. झिल्ली में छिद्र के आकार का चयन ब्याज की कोशिका के आकार के आधार पर किया जा सकता है। इस परियोजना के लिए, हमने 3 मीटर छिद्रयुक्त झिल्ली का चयन किया, क्योंकि लसीकाभ कोशिकाएं 7-20 उ उ हैं, जो कोशिकीय विकास की अवस्था के आधार पर होती हैं। यह छिद्र आकार यह सुनिश्चित करता है कि ये कोशिकाएं छिद्रों के माध्यम से निष्क्रिय रूप से नहीं गिर रही हैं, लेकिन वे सक्रिय रूप से chemokine ढाल के जवाब में पलायन कर रहे हैं।

इस प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ इसकी लागत प्रभावशीलता है. Vivo transmigration में मुश्किल है क्योंकि यह पशु हैंडलिंग और सर्जरी में व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता है, और अक्सर उच्च स्तरीय माइक्रोस्कोपी है कि हमेशा एक शोधकर्ता के लिए उपलब्ध नहीं है शामिल है. यौगिकों की लागत प्रभावी स्क्रीनिंग को बढ़ाने या स्थानांतरण को बाधित करने के लिए सोचा vivo इमेजिंग में अग्रिम में पूरा किया जा सकता है. क्योंकि स्थानांतरण प्रणाली कसकर नियंत्रित किया जाता है, कोशिकाओं को शुरू में इलाज किया जा सकता है तो transwell उपकरण में जोड़ा, या, इसके विपरीत, chemokine पहले एक chemokine अवरोध करनेवाला के साथ इलाज किया जा सकता है तो कोशिकाओं transwell उपकरण में जोड़ा. अंत में, endothelial कोशिकाओं और / या तहखाने झिल्ली प्रोटीन transwell डालने के नीचे करने के लिए जोड़ा जा सकता है 1-2 दिन पहले स्थानांतरण प्रयोग करने के लिए chemokinetics में इन बाधा कोशिकाओं की भागीदारी को समझने के लिए. फिर, प्रणाली के इन जोड़तोड़ vivo अध्ययन में और अधिक जटिल के अग्रिम में एक दिया यौगिक की प्रभावशीलता के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी का निर्धारण करने का एक शक्तिशाली साधन प्रदान करते हैं.

एक स्थानांतरण कक्ष प्रणाली का उपयोग विवो में विभिन्न के तहत लिम्फोसाइट गतिशीलता का आकलन करने के लिए एक प्रभावी तरीका है और इन विट्रो स्थितियोंमें 12,13,14. इसमें, हम एक स्थानांतरण कक्ष में chemokines के लिए पूर्व vivo लिम्फोसाइट प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन. इस उदाहरण प्रयोग में, CD4+ T कोशिकाओं और समूह 2 जन्मजात लसीकाभ कोशिकाओं (ILC2) पुरुष और महिला से अलग थे, BALB/c चूहों OVA-एलर्जी जोखिम के बाद. एक परिकल्पना उत्पन्न की गई थी कि CCR4+ CD45+ Lineage- (LIN-) ILC2 एलर्जी-चुनौती चूहों से CCL17 और CCL22 CCR4+ CD4+ T सहायक कोशिकाओं की तुलना में अधिक कुशलता से माइग्रेट होगा. सीसीएल17 और सीसीएल22 आमतौर पर डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं और एम 2 (एलर्जिक) फीनोटाइप के मैक्रोफेज द्वारा उत्पादित कीमोकिन हैं, अन्य कोशिकाओं के बीच, एलर्जी15,16में । सीसीएल17 और सीसीएल22 को एलर्जी की सूजन के बायोमार्कर के रूप में माना जा सकता है क्योंकि वायुमार्ग में16,17,18के दौरान फेफड़ों में आसानी से पाया जाता है . महत्वपूर्ण बात, CCR4 अभिव्यक्ति अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में ऊंचा है, के रूप में घर धूल घुन इलाज जानवरों से अलग ILC2 से उत्पन्न bioinformatic डेटा में पता चला है, और इसी तरह IL-33 के साथ पूर्व vivo इलाज किया ( एलर्जी को बढ़ावा देने जन्मजात साइटोकिन) CCR419,20को नियंत्रित करता है। इसके अलावा, इम्यूनोलॉजिकल जीनोम परियोजना डेटाबेस (www.immgen.org) में आईएलसी 2 के लिए डेटा के अनुसार, CCR4 MRNA अत्यधिक इन जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं में व्यक्त की है. तारीख करने के लिए, थोड़ा ऊतकों में ILC2 के अवैध व्यापार के बारे में जाना जाता है, लेकिन यह संभावना है कि ILC2 और CD4+ टी कोशिकाओं chemotaxis और chemokinetics के लिए इसी तरह की chemokines और रिसेप्टर्स का उपयोग के रूप में वे इसी तरह के प्रतिलेखन कारकों और रिसेप्टर्स व्यक्त करते हैं. इस प्रकार, हम सीसीएल17 बनाम CCL22 जवाबदेही की तुलना में, ILC2 और CD4+ टी लिम्फोसाइटों, दोनों पुरुष और महिला, OVA-चुनौती पशुओं से.

Protocol

यहाँ वर्णित सभी तरीकों की समीक्षा की और नेब्रास्का मेडिकल सेंटर (UNMC) और यूटा विश्वविद्यालय के विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया. 1. सेटअप और अभि?…

Representative Results

CD4 + T कक्षों और ILC2 पर CCR4 व्यंजक. पूर्व vivo स्थानांतरण प्रयोग की सफलता के लिए, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या लिम्फोसाइटों CCL17 और CCR4 के माध्यम से CCL22 के लिए उत्तरदायी हैं आवश्यक है; इसलिए, हमने प्?…

Discussion

इसमें, हम एक पूर्व विवो स्थानांतरण प्रणाली में लिम्फोसाइटों के chemokine प्रेरित प्रवास का आकलन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि पेश करते हैं। प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं, जिनमें से पहले प्र?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम अमेरिकी फेफड़े एसोसिएशन (K.J.W.), मेमोरियल यूजीन Kenney निधि T.A.W. और K.J.W. को सम्मानित किया, K.J.W. के लिए यूटा विश्वविद्यालय से उदार शुरू समर्थन द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और T.A.W. (VA I01BX0003635) के लिए दिग्गजों मामलों के पुरस्कार के एक विभाग. T.A.W. दिग्गजों मामलों के विभाग से एक अनुसंधान कैरियर वैज्ञानिक पुरस्कार (IK6 BX003781) के प्राप्तकर्ता है. लेखक सुश्री लिसा चुडोमेल्का से संपादकीय सहायता स्वीकार करना चाहते हैं। लेखक इस पांडुलिपि के लिए उत्पन्न प्रवाह साइटोमेट्री डेटा एकत्र करने में उनके समर्थन के लिए UNMC फ्लो साइटोमेट्री कोर का धन्यवाद करते हैं।

Materials

0.4% Trypan Blue Sigma-Aldrich 15250061
1 mL syringe BD Bioscience 329424 U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2" 1cc
100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine Gibco 10378-016 Dilute to 1x in RPMI media
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101 polypropylene tubes
3 um transwell inserts Genesee Scientific 25-288 24-well plate containing 12 transwell inserts
3x stabilizing fixative BD Pharmigen 338036 Prepare 1x solution according to manufacturers protocol
5 mL polystyrene tubes STEM Cell Technologies 38007
50 mL conical tubes Olympus Plastics 28-106 polypropylene tubes
8-chamber easy separation magnet STEM Cell Technologies 18103
ACK Lysing Buffer Life Technologies Corporation A1049201
Advanced cell strainer, 40 um Genesee Scientific 25-375 nylon mesh, 40 micron strainers
Aluminum Hydroxide, Reagent Grade Sigma-Aldrich 239186-25G 20 mg/mL
anti- mouse CCR4; APC-conjugated Biolegend 131211 0.5 ug/test
anti-mouse CD11b BD Pharmigen 557396 0.5 ug/test
anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 Thermo-Fischer Scientific 61-0114-82 0.25 ug/test
anti-mouse CD16/32, Fc block BD Pharmigen 553141 0.5 ug/test
anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated Thermo-Fischer Scientific 47-0193-82 0.5 ug/test
anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated BD Pharmigen 552774 0.25 ug/test
anti-mouse CD45; PE conjugated BD Pharmigen 56087 0.5 ug/test
anti-mouse ICOS (CD278) BD Pharmigen 564070 0.5 ug/test
anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated BD Pharmigen 553164 0.25 ug/test
anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated Biolegend 145311 0.5 ug/test
Automated Cell Counter BIORAD 1450102
Automated Dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235
Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder Sigma-Aldrich A2153-10G 0.5% in serum-free RPMI
Cell Counter Clides BIORAD 1450015
Chicken Egg Ovalbumin, Grade V Sigma-Aldrich A5503-10G 500 ug/mL
Collagenase, Type 1, Filtered Worthington Biochemical Corporation CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) 25 U/mL in RPMI
compensation beads Affymetrix 01-1111-41 1 drop per contol tube
Dissociation Tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-335
FACS Buffer BD Pharmigen 554657 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C
Heat Inactivated-FBS Genesee Scientific 25-525H 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media
mouse CCL17 GenScript Z02954-20 50 ng/mL
mouse CCL22 GenScript Z02856-20 50 ng/mL
mouse CD4+ T cell enrichment kit STEM Cell Technologies 19852
mouse IL-2 GenScript Z02764-20 20 ng/mL
mouse ILC2 enrichment kit STEM Cell Technologies 19842
mouse recombinant IL-33 STEM Cell Technologies 78044 20 ng/mL
RPMI Life Technologies Corporation 22400071
Separation Buffer STEM Cell Technologies 20144 1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C
small animal nebulizer and chamber Data Sciences International
sterile saline Baxter 2F7124; NDC 0338-0048-04 0.9% Sodium Chloride

References

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check_url/fr/60060?article_type=t&slug=assessment-of-lymphocyte-migration-in-an-ex-vivo-transmigration-system

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Citer Cet Article
Warren, K. J., Wyatt, T. A. Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System. J. Vis. Exp. (151), e60060, doi:10.3791/60060 (2019).

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