Valutazione della migrazione dei linfociti in un sistema di trasmigrazione Ex Vivo
Summary
In questo protocollo, i linfociti sono collocati nella camera superiore di un sistema di trasmigrazione, separato dalla camera inferiore da una membrana porosa. La chemiochina viene aggiunta alla camera inferiore, che induce una migrazione attiva lungo un gradiente di chemiochina. Dopo 48 h, i linfociti vengono contati in entrambe le camere per quantificare la trasmigrazione.
Abstract
Qui, presentiamo un metodo efficiente che può essere eseguito con competenze di laboratorio di base e materiali per valutare il movimento chemiocitico linfocitico in un sistema di trasmigrazione ex vivo. Le cellule linfoidi innate di gruppo 2 (ILC2) e le cellule helper T CD4– Le cellule helper T sono state isolate dalla milza e dai polmoni di topi BALB/c sfidati da uovo di gallina . Abbiamo confermato l’espressione di CCR4 su entrambe le cellule CD4– T e ILC2, comparativamente. CCL17 e CCL22 sono i ligandi noti per CCR4; quindi, utilizzando questo metodo di trasmigrazione ex vivo abbiamo esaminato il movimento clatuano 17– e il movimento indotto da CCL22 dei linfociti. Per stabilire i gradienti di chemiochina, CCL17 e CCL22 sono stati collocati nella camera inferiore del sistema di trasmigrazione. I linfociti isolati sono stati poi aggiunti alle camere superiori e in un periodo di 48 ore i linfociti sono migrati attivamente attraverso 3 pori di m verso la chemiochina nella camera inferiore. Si tratta di un sistema efficace per determinare la chemiocineticidei dei linfociti, ma, comprensibilmente, non imita le complessità che si trovano nei microambienti di organi in vivo. Questa è una limitazione del metodo che può essere superata con l’aggiunta di imaging in situ dell’organo e dei linfociti in fase di studio. Al contrario, il vantaggio di questo metodo è che può essere eseguito da un tecnico entry-level ad un tasso molto più conveniente rispetto all’imaging dal vivo. Man mano che i composti terapeutici diventano disponibili per migliorare la migrazione, come nel caso dell’infiltrazione del tumore delle cellule immunitarie citotossiche, o per inibire la migrazione, forse nel caso di malattie autoimmuni in cui l’immunopatologia è preoccupante, questo metodo può essere utilizzato come strumento di screening. In generale, il metodo è efficace se la chemiochina di interesse genera costantemente chemiocinetici ad un livello statisticamente superiore rispetto al controllo multimediale. In questi casi, il grado di inibizione/miglioramento da un dato composto può essere determinato pure.
Introduction
Questo metodo di trasmigrazione originale è stato presentato da Stephen Boyden nel 1962 nel Journal of Experimental Medicine1. Gran parte di ciò che sappiamo sulla chemiotassia e sulla chemiocinetia non sarebbe possibile senza lo sviluppo della camera di Boyden. Prima della scoperta della prima chemiochina nel 1977, i sistemi di trasmigrazione ex vivo sono stati utilizzati per conoscere i fattori del siero che potrebbero arrestare il movimento cellulare nei macrofagi amplificando la motilità cellulare nei neutrofili1,2. Una massiccia ricchezza di conoscenze è stata sviluppata per quanto riguarda la migrazione delle cellule immunitarie, e ad oggi, 47 chemiochine sono state scoperte con 19 recettori corrispondenti3,4. Inoltre, moltitudini di inibitori/miglioratori di queste vie chemiochine hanno subito lo sviluppo per scopi terapeutici5,6,7,8. Molti di questi composti sono stati testati in camere di trasmigrazione simili per comprendere le interazioni dirette tra i composti e la reattività delle cellule immunitarie a una data chemiochina9.
La trasmigrazione, o diapedesi, nel tessuto infiammato è un processo essenziale per una risposta infiammatoria sana alla chiara infezione10,11. Una camera Boyden, un sistema di trasmigrazione o un apparato transwell sono generalmente composti da due camere separate da una membrana porosa1,12. La camera inferiore contiene più spesso supporti contenenti la chemiochina di interesse, mentre i leucociti sono collocati nella camera superiore. La dimensione del poro nella membrana può essere selezionata in base alle dimensioni della cella di interesse. Per questo progetto, abbiamo selezionato una membrana porosa di 3 m, poiché le cellule linfoidi hanno una dimensione di 7-20 m, a seconda dello stadio di sviluppo cellulare. Questa dimensione dei pori assicura che queste cellule non cadono passivamente attraverso i pori, ma che stanno migrando attivamente in risposta al gradiente della chemiochina.
Il principale vantaggio di questo protocollo è la sua efficacia in termini di costi. La trasmigrazione in vivo è difficile perché richiede un’ampia formazione nella manipolazione e nella chirurgia degli animali, e spesso coinvolge microscopia ad alta potenza che non è sempre disponibile per un ricercatore. Lo screening economico dei composti pensati per migliorare o inibire la trasmigrazione può essere realizzato prima dell’imaging in vivo. Poiché il sistema di trasmigrazione è strettamente controllato, le cellule possono essere trattate inizialmente e poi aggiunte all’apparato transwell, o, viceversa, la chemiochina può essere trattata prima con un inibitore della chemiochina e poi le cellule aggiunte all’apparato transwell. Infine, le cellule endoteliali e/o le proteine della membrana sotterranea possono essere aggiunte sul fondo dell’inserto transwell 1-2 giorni prima dell’esperimento di trasmigrazione per comprendere il coinvolgimento di queste cellule barrierative nella chemiocinetica. Ancora una volta, queste manipolazioni del sistema forniscono un potente mezzo per determinare importanti informazioni sull’efficacia di un dato composto prima di studi in vivo più complicati.
L’utilizzo di un sistema camera di trasmigrazione è un modo efficace per valutare la mobilità dei linfociti in varie condizioni in vivo e in vitro12,13,14. Qui, descriviamo un metodo ottimizzato per valutare la reattività dei linfociti ex vivo alle chemiochine in una camera di trasmigrazione. In questo esperimento di esempio, CD4– cellule T e cellule linfoidi innate di gruppo 2 (ILC2) sono state isolate dai topi maschi e femmine, BALB/c in seguito all’esposizione all’OVA-allergene. È stata generata un’ipotesi che CCR4– CD45– Lineage- (LIN-) ILC2 da topi con problemi di allergene migrerebbe in modo più efficiente verso CCL17 e CCL22 rispetto alle cellule helper CCR4 – CD4– T. CCL17 e CCL22 sono chemiochine comunemente prodotte da cellule dendritiche e macrofagi del fenotipo M2 (allergico), tra le altre cellule, nell’allergia15,16. CCL17 e CCL22 possono essere considerati come biomarcatori di infiammazione allergica in quanto sono prontamente rilevati nei polmoni durante le esacerbazioni delle vieaeree 16,17,18. È importante sottolineare che l’espressione di CCR4 è elevata rispetto ai controlli non trattati, come rivelato nei dati bioinformatici generati da ILC2 isolati da animali trattati con acari della polvere domestica, e allo stesso modo ILC2 da animali ingenui trattati ex vivo con IL-33 ( citochina innata che promuove gli allergeni) aumenta la regolazione CCR419,20. Inoltre, secondo i dati relativi all’ILC2 nel database del progetto immunologico del genoma (www.immgen.org), l’mRNA CCR4 è altamente espresso in queste cellule immunitarie innate. Ad oggi, poco è noto per quanto riguarda il traffico di ILC2 in tessuti, ma è probabile che le cellule ILC2 e CD4– T utilizzano chemiochine e recettori simili per chemiotassi e chemiocinetiche in quanto esprimono fattori e recettori di trascrizione simili. Così, abbiamo confrontato CCL17 e CCL22 reattività, di ILC2 e CD4– linfociti T, da entrambi gli animali maschi e femmine, OVA-sfidato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, presentiamo un metodo ben consolidato per valutare la migrazione indotta dalla chemiocinetta dei linfociti in un sistema di trasmigrazione ex vivo. Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo, il primo dei quali è verificare l’espressione del corretto recettore della chemiochina sulle cellule immunitarie nell’esperimento. Nelle nostre mani, abbiamo scelto CCR4 a causa del corpo della letteratura che sottolinea l’importanza di CCR4 sulle cellule T helper Th2 nell’infiammazione allergica. L’infiammazione indotta …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dall’American Lung Association (K.J.W.), dal fondo Memorial Eugene Kenney assegnato a T.A.W. e K.J.W., dal generoso sostegno avviato dall’Università dello Utah per K.J.W. e da un premio del Dipartimento degli affari dei veterani a T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. è stato insignito di un Research Career Scientist Award (IK6 BX003781) del Dipartimento degli Affari Veterani. Gli autori desiderano riconoscere l’assistenza editoriale della signora Lisa Chudomelka. Gli autori ringraziano il nucleo Citometry di UnMC Flow per il loro sostegno nella raccolta dei dati della citometria di flusso generati per questo manoscritto.
Materials
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 15250061 | |
| 1 mL syringe | BD Bioscience | 329424 | U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2" 1cc |
| 100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Dilute to 1x in RPMI media |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | polypropylene tubes |
| 3 um transwell inserts | Genesee Scientific | 25-288 | 24-well plate containing 12 transwell inserts |
| 3x stabilizing fixative | BD Pharmigen | 338036 | Prepare 1x solution according to manufacturers protocol |
| 5 mL polystyrene tubes | STEM Cell Technologies | 38007 | |
| 50 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-106 | polypropylene tubes |
| 8-chamber easy separation magnet | STEM Cell Technologies | 18103 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies Corporation | A1049201 | |
| Advanced cell strainer, 40 um | Genesee Scientific | 25-375 | nylon mesh, 40 micron strainers |
| Aluminum Hydroxide, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 239186-25G | 20 mg/mL |
| anti- mouse CCR4; APC-conjugated | Biolegend | 131211 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen | 557396 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 | Thermo-Fischer Scientific | 61-0114-82 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD16/32, Fc block | BD Pharmigen | 553141 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated | Thermo-Fischer Scientific | 47-0193-82 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated | BD Pharmigen | 552774 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD45; PE conjugated | BD Pharmigen | 56087 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse ICOS (CD278) | BD Pharmigen | 564070 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated | BD Pharmigen | 553164 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated | Biolegend | 145311 | 0.5 ug/test |
| Automated Cell Counter | BIORAD | 1450102 | |
| Automated Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | A2153-10G | 0.5% in serum-free RPMI |
| Cell Counter Clides | BIORAD | 1450015 | |
| Chicken Egg Ovalbumin, Grade V | Sigma-Aldrich | A5503-10G | 500 ug/mL |
| Collagenase, Type 1, Filtered | Worthington Biochemical Corporation | CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) | 25 U/mL in RPMI |
| compensation beads | Affymetrix | 01-1111-41 | 1 drop per contol tube |
| Dissociation Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-335 | |
| FACS Buffer | BD Pharmigen | 554657 | 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C |
| Heat Inactivated-FBS | Genesee Scientific | 25-525H | 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media |
| mouse CCL17 | GenScript | Z02954-20 | 50 ng/mL |
| mouse CCL22 | GenScript | Z02856-20 | 50 ng/mL |
| mouse CD4+ T cell enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19852 | |
| mouse IL-2 | GenScript | Z02764-20 | 20 ng/mL |
| mouse ILC2 enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19842 | |
| mouse recombinant IL-33 | STEM Cell Technologies | 78044 | 20 ng/mL |
| RPMI | Life Technologies Corporation | 22400071 | |
| Separation Buffer | STEM Cell Technologies | 20144 | 1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C |
| small animal nebulizer and chamber | Data Sciences International | ||
| sterile saline | Baxter | 2F7124; NDC 0338-0048-04 | 0.9% Sodium Chloride |
References
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