Ex Vivo 트랜스이민 시스템에서 림프구 마이그레이션 평가
Summary
이 프로토콜에서 림프구는 다공성 멤브레인에 의해 하단 챔버로부터 분리 된 트랜스 이민 시스템의 상부 챔버에 배치됩니다. 케모카인은 하단 챔버에 첨가되어 케모카인 그라데이션을 따라 활발한 이동을 유도합니다. 48 시간 후, 림프구는 트랜스 이민을 정량화하기 위해 두 챔버에서 계산됩니다.
Abstract
본 명세서에서, 우리는 생체 내 트랜스이민 시스템에서 림프구 케모카네틱 운동을 평가하기 위한 기본적인 실험실 기술 및 물질로 실행될 수 있는 효율적인 방법을 제시한다. 그룹 2 선천림프세포(ILC2) 및CD4+ T 도우미 세포를 닭계란 ovalbumin(OVA)-도전BALB/c 마우스의 비장 및 폐로부터 분리하였다. 우리는CD4+ T 세포 및 ILC2 둘 다에서 CCR4의 발현을 비교적 확인하였다. CCL17 및 CCL22는 CCR4에 대해 공지된 리간드; 따라서, 이러한 생체 내 이주 방법을 사용하여CCL17-및 CCR22-유도 된 CCR4+ 림프구의 이동을 조사하였다. 케모카인 그라데이션을 확립하기 위해 CCL17 및 CCL22를 마이그레이션 시스템의 하단 챔버에 배치했습니다. 분리된 림프구는 상부 챔버에 첨가하고 48h 기간 동안 림프구가 3 μm 기공을 통해 활발하게 이동하여 하단 챔버의 케모카인을 향하게 했다. 이것은 림프구의 화학 요법을 결정하기위한 효과적인 시스템이지만, 당연히 생체 내 장기 미세 환경에서 발견되는 복잡성을 모방하지는 않습니다. 이것은 연구 하에 기관 및 림프구의 실화 화상 진찰에 추가함으로써 극복 될 수있는 방법의 한 가지 한계이다. 대조적으로, 이 방법의 장점은 엔트리 레벨 기술자가 라이브 이미징보다 훨씬 더 비용 효율적인 속도로 수행 될 수 있다는 것입니다. 종양이 세포독성 면역 세포에 침투하는 경우와 같이 치료 화합물이 이동을 향상시키거나 이동을 억제할 수 있게 됨에 따라, 아마도 면역병리학이 우려되는 자가면역 질환의 경우, 이 방법은 스크리닝 도구. 일반적으로, 이 방법은 관심 있는 케모카인이 미디어 제어보다 통계적으로 더 높은 수준에서 화학을 일관되게 생성하는 경우에 효과적이다. 이러한 경우에, 주어진된 화합물에 의해 억제/향상의 정도 또한 결정 될 수 있다.
Introduction
이 원래 이주 방법은 실험 의학의 전표에서1962년에 스티븐 보이든에 의해 제출되었습니다1. 우리가 화학 요법과 화학 요법에 대해 알고있는 많은 것은 Boyden 챔버의 개발없이 가능하지 않을 것입니다. 1977년에 첫번째 chemokine의 발견이전에, ex vivo transmigration 시스템은 호중구에 있는 세포 운동성을 증폭하는 동안 대식세포에 있는 세포 운동을 체포할 수 있던 혈청 요인에 관하여 배우기 위하여 이용되었습니다1,2. 면역 세포 이동에 관한 지식의 엄청난 재산이 개발되었습니다, 현재까지, 47 케모카인은 지금 발견되었습니다 19 해당 수용체3,4. 또한, 이러한 케모카인 경로의 억제제 / 강화제의 무리는 치료 목적을 위한 개발을 겪고있다5,6,7,8. 그 화합물의 많은 주어진된 chemokine에 화합물과 면역 세포 응답 성 간의 직접적인 상호 작용을 이해 하기 위해 유사한 마이그레이션 챔버에서 테스트 되었습니다9.
이민, 또는 diapedesis, 염증된 조직으로 명확한 감염에 건강한 선동적인 반응에 필수적인 과정10,11. 보이든 챔버, 트랜스이민 시스템, 또는 트랜스웰 장치는 일반적으로 다공성 멤브레인1,12에의해 분리된 2개의 챔버로 구성된다. 바닥 챔버는 가장 자주 관심의 케모카인을 포함하는 미디어를 보유하고, 백혈구는 상단 챔버에 배치되는 동안. 막 내의 기공의 크기는 관심 있는 세포의 크기에 기초하여 선택될 수 있다. 이 프로젝트의 경우, 우리는 림프세포의 크기가 7-20 μm이기 때문에 세포 발달 단계에 따라 3 μm 다공성 멤브레인을 선택했습니다. 이 기공 크기는 이 세포가 수동적으로 모공을 통해 떨어지는 것이 아니라 케모카인 구배에 반응하여 적극적으로 이동한다는 것을 보장합니다.
이 프로토콜의 주요 장점은 비용 효율성입니다. 생체 내 이주는 동물 취급 및 수술에 있는 광대한 훈련을 요구하기 때문에 어렵고, 수시로 연구원에게 항상 유효하지 않는 고성능 현미경 검사법을 관련시킵니다. 이주를 강화하거나 억제하기 위해 생각되는 화합물의 비용 효과적인 스크리닝은 생체 내 이미징에 앞서 달성될 수 있다. 트랜스이민 시스템은 엄격하게 조절되기 때문에, 세포는 트랜스웰 장치에 처음에 첨가된 후 처리될 수 있거나, 또는 그 반대의 경우도 마찬가지이며, 케모카인은 트랜스웰 장치에 첨가된 세포후 케모카인 억제제로 먼저 치료될 수 있다. 마지막으로, 내피 세포 및/또는 지하 막 단백질은 트랜스웰 삽입의 바닥에 첨가될 수 있다 1-2 화학학에서 이러한 장벽 세포의 참여를 이해하기 위해 이주 실험 1-2일 전에. 다시, 시스템의 이러한 조작은 생체 내 연구에서 보다 복잡한 연구에 앞서 주어진 화합물의 효과에 대한 중요한 정보를 결정하는 강력한 수단을 제공한다.
이주 챔버 시스템을 활용하는 것은 생체 내 및 체외 조건 하에서 다양한 림프구 이동성을 평가하는 효과적인방법(12,13,14)이다. 본 명세서에서, 우리는 트랜스이민 챔버에서 케모카인에 대한 생체 림프구 반응성을 평가하기 위한 최적화된 방법을 설명한다. 본 실시예 실험에서,CD4+ T 세포 및 그룹 2 선천성 림프성 세포(ILC2)는 OVA 알러지 유발 물질 노출 다음의 남성 및 여성, BALB/c 마우스로부터 분리되었다. 알레르겐 도전 마우스로부터 CCR4+ CD45+ 리니지-(LIN-) ILC2가 CCR4+ CD4+ T 도우미 세포보다 CCL17 및 CCL22로 보다 효율적으로 마이그레이션될 것이라는 가설이 생성되었다. CCL17 및 CCL22는 일반적으로 M2 (알레르기성) 표현형의 수지상 세포 및 대식세포에 의해 생성되는 케모카인이며, 다른 세포들 중에서, 알레르기15,16. CCL17 및 CCL22는 기도 악화 시 폐에서 쉽게 검출되기 때문에 알레르기 성 염증의 바이오마커로 생각될 수 있다16,17,18. 중요한 것은, CCR4 발현은 집 먼지 마이트 처리 동물로부터 분리된 ILC2로부터 생성된 생물정보학 데이터에서 밝혀진 바와 같이, 처리되지 않은 대조군과 비교하여 상승되고, 유사하게 ILC2는 IL-33으로 생체내 처리된 순진한 동물로부터 알레르겐 촉진 선천적 사이토카인) upregulates CCR419,20. 더욱이, 면역학적 게놈 프로젝트 데이터베이스(www.immgen.org)에서 ILC2에 대한 데이터에 따르면, CCR4 mRNA는 이들 선천적인 면역 세포에서 고도로 발현된다. 현재까지, 조직으로 ILC2의 인신 매매에 관하여 거의 알려져 있지 않습니다, 그러나 ILC2와 CD4+ T 세포는 유사한 전사 인자 및 수용체를 표현하기 때문에 화학요법과 화학요법을 위한 유사한 케모카인 및 수용체를 이용하기 위하여 확률이 높습니다. 따라서, 우리는 CCL17 대 CCL22 응답성, ILC2 및 CD4+ T 림프구, 남성과 여성 모두에서, OVA 도전 동물을 비교했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 명세서에서, 우리는 생체 내 트랜스이민 시스템에서 림프구의 케모카인 유도 이동을 평가하기 위한 잘 확립된 방법을 제시한다. 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있으며, 그 중 첫 번째는 실험에서 면역 세포에 대한 올바른 케모카인 수용체의 발현을 확인하는 것입니다. 우리의 손에, 우리는 알레르기성 염증에 있는 Th2 도우미 T 세포에 CCR4의 중요성을 강조하는 문헌의 바디 때문에 CCR4를 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 미국 폐 협회 (K.J.W.), T.A.W.와 K.J.W.에 수여 된 기념 유진 케니 기금, K.J.W.에 대한 유타 대학의 관대 한 창업 지원, T.A.W.에 재향 군인 업무 상 (VA I01BX003335)에 의해 지원되었다. T.A.W.는 재향 군인 국무부에서 연구 경력 과학자 상 (IK6 BX003781)의 수상자입니다. 저자는 리사 추도멜카 씨의 편집 지원을 인정하고 자합니다. 저자는 이 원고에 대해 생성된 유세포분석 데이터를 수집하는 데 도움을 준 UNMC 흐름 세포분석 코어에 감사를 표합니다.
Materials
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 15250061 | |
| 1 mL syringe | BD Bioscience | 329424 | U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2" 1cc |
| 100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Dilute to 1x in RPMI media |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | polypropylene tubes |
| 3 um transwell inserts | Genesee Scientific | 25-288 | 24-well plate containing 12 transwell inserts |
| 3x stabilizing fixative | BD Pharmigen | 338036 | Prepare 1x solution according to manufacturers protocol |
| 5 mL polystyrene tubes | STEM Cell Technologies | 38007 | |
| 50 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-106 | polypropylene tubes |
| 8-chamber easy separation magnet | STEM Cell Technologies | 18103 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies Corporation | A1049201 | |
| Advanced cell strainer, 40 um | Genesee Scientific | 25-375 | nylon mesh, 40 micron strainers |
| Aluminum Hydroxide, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 239186-25G | 20 mg/mL |
| anti- mouse CCR4; APC-conjugated | Biolegend | 131211 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen | 557396 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 | Thermo-Fischer Scientific | 61-0114-82 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD16/32, Fc block | BD Pharmigen | 553141 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated | Thermo-Fischer Scientific | 47-0193-82 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated | BD Pharmigen | 552774 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD45; PE conjugated | BD Pharmigen | 56087 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse ICOS (CD278) | BD Pharmigen | 564070 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated | BD Pharmigen | 553164 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated | Biolegend | 145311 | 0.5 ug/test |
| Automated Cell Counter | BIORAD | 1450102 | |
| Automated Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | A2153-10G | 0.5% in serum-free RPMI |
| Cell Counter Clides | BIORAD | 1450015 | |
| Chicken Egg Ovalbumin, Grade V | Sigma-Aldrich | A5503-10G | 500 ug/mL |
| Collagenase, Type 1, Filtered | Worthington Biochemical Corporation | CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) | 25 U/mL in RPMI |
| compensation beads | Affymetrix | 01-1111-41 | 1 drop per contol tube |
| Dissociation Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-335 | |
| FACS Buffer | BD Pharmigen | 554657 | 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C |
| Heat Inactivated-FBS | Genesee Scientific | 25-525H | 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media |
| mouse CCL17 | GenScript | Z02954-20 | 50 ng/mL |
| mouse CCL22 | GenScript | Z02856-20 | 50 ng/mL |
| mouse CD4+ T cell enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19852 | |
| mouse IL-2 | GenScript | Z02764-20 | 20 ng/mL |
| mouse ILC2 enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19842 | |
| mouse recombinant IL-33 | STEM Cell Technologies | 78044 | 20 ng/mL |
| RPMI | Life Technologies Corporation | 22400071 | |
| Separation Buffer | STEM Cell Technologies | 20144 | 1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C |
| small animal nebulizer and chamber | Data Sciences International | ||
| sterile saline | Baxter | 2F7124; NDC 0338-0048-04 | 0.9% Sodium Chloride |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).
- Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
- Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
- Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).
- Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
- Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn’s and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).
- Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
- Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
- Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
- Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
- Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
- Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
- Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
- Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
- Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).
- Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
- Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
- Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).
- Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
- Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).
- Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
- Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
- Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
- Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
- Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
- Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
- Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
- Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
- Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).
