Dieses Protokoll nutzte ein kommerziell erhältliches Druckmyographensystem, um Druckmyographentests an der murinen Vagina und dem Gebärmutterhals durchzuführen. Unter Verwendung von Medien mit und ohne Kalzium wurden die Beiträge der glatten Muskelzellen (SMC) Basalton und der passiven extrazellulären Matrix (ECM) für die Organe unter geschätzten physiologischen Bedingungen isoliert.
Die weiblichen Fortpflanzungsorgane, insbesondere die Vagina und der Gebärmutterhals, bestehen aus verschiedenen zellulären Komponenten und einer einzigartigen extrazellulären Matrix (ECM). Glatte Muskelzellen weisen eine kontraktile Funktion innerhalb der Vaginal- und Gebärmutterhalswände auf. Je nach biochemischer Umgebung und mechanischer Dehnung der Organwände verändern die glatten Muskelzellen die kontraktilen Bedingungen. Der Beitrag der glatten Muskelzellen unter physiologischen Ausgangsbedingungen wird als Basalton klassifiziert. Genauer gesagt, ein Basalton ist die grundlegende partielle Verengung von glatten Muskelzellen in Abwesenheit von hormoneller und neuronaler Stimulation. Darüber hinaus bietet das ECM strukturelle Unterstützung für die Orgelwände und fungiert als Reservoir für biochemische Hinweise. Diese biochemischen Hinweise sind entscheidend für verschiedene Organfunktionen, wie anregendes Wachstum und Aufrechterhaltung der Homöostase. Das ECM jedes Organs besteht hauptsächlich aus Kollagenfasern (meist Kollagentypen I, III und V), elastischen Fasern und Glycosaminoglycans/Proteoglykanen. Die Zusammensetzung und Organisation des ECM bestimmen die mechanischen Eigenschaften jedes Organs. Eine Änderung der ECM-Zusammensetzung kann zur Entwicklung von reproduktiven Pathologien führen, wie Beckenorganprolaps oder vorzeitige Zervix-Umbau. Darüber hinaus können Veränderungen der ECM-Mikrostruktur und Steifigkeit die Aktivität der glatten Muskelzellen und den Phänotyp verändern und somit zum Verlust der kontraktilen Kraft führen.
In dieser Arbeit werden die gemeldeten Protokolle verwendet, um den Basalton und die passiven mechanischen Eigenschaften der nicht schwangeren murinen Vagina und des Gebärmutterhalses im Alter von 4-6 Monaten in Estrus zu bewerten. Die Organe wurden in einem handelsüblichen Druckmyographen montiert und sowohl Druckdurchmesser- als auch Kraftlängentests durchgeführt. Beispieldaten und Datenanalysetechniken zur mechanischen Charakterisierung der Fortpflanzungsorgane sind enthalten. Solche Informationen können nützlich sein, um mathematische Modelle zu konstruieren und therapeutische Interventionen für Die Gesundheitspathologien von Frauen rational zu gestalten.
Die Vaginalwand besteht aus vier Schichten, dem Epithel, Lamina propria, Muscularis und Adventitia. Das Epithel besteht hauptsächlich aus Epithelzellen. Die Lamina Propria hat eine große Menge an elastischen und fibrillaren Kollagenfasern. Die Muskulatur besteht auch aus Elastin und Kollagenfasern, hat aber eine erhöhte Menge an glatten Muskelzellen. Die Adventitia besteht aus Elastin, Kollagen und Fibroblasten, wenn auch in reduzierten Konzentrationen im Vergleich zu den vorherigen Schichten. Die glatten Muskelzellen sind für biomechanisch motivierte Forschungsgruppen von Interesse, da sie eine Rolle in der kontraktilen Natur der Organe spielen. Daher ist die Quantifizierung der glatten Muskelzellbereichsfraktion und -organisation der Schlüssel zum Verständnis der mechanischen Funktion. Frühere Untersuchungen deuten darauf hin, dass der glatte Muskelgehalt innerhalb der Vaginalwand in erster Linie in der Umfangs- und Längsachse organisiert ist. Histologische Analysen deuten darauf hin, dass der glatte Muskelbereichsanteil für die proximalen und distalen Abschnitte der Wand1etwa 35% beträgt.
Der Gebärmutterhals ist eine hoch kollagenige Struktur, die bis vor kurzem gedacht wurde, um minimalen glatten Muskelzellgehalt2,3. Neuere Studien haben jedoch darauf hingedeutet, dass glatte Muskelzellen eine größere Fülle und Rolle im Gebärmutterhals4,5haben können. Der Gebärmutterhals weist einen Gradienten von glatten Muskelzellen auf. Das interne os enthält 50-60% glatte Muskelzellen, bei denen das externe Os nur 10% enthält. Maus-Studien, jedoch, berichten, dass der Gebärmutterhals aus 10-15% glatten Muskelzellen und 85-90% faserigem Bindegewebe ohne Erwähnung der regionalen Unterschiede6,7,8. Da sich das Mausmodell vom häufig gemeldeten menschlichen Modell unterscheidet, sind weitere Untersuchungen zum Maus-Gebärmutterhals erforderlich.
Der Zweck dieses Protokolls war es, die mechanischen Eigenschaften der murinen Vagina und des Gebärmutterhalses aufzuklären. Dies wurde durch die Verwendung einer Druckmyographenvorrichtung erreicht, die die gleichzeitige Beurteilung der mechanischen Eigenschaften in den umlaufenden und axialen Richtungen ermöglicht und dabei die nativen Zellmatrix-Wechselwirkungen und die Organgeometrie beibehält. Die Orgeln wurden auf zwei kundenspezifischen Kanülen montiert und mit Seide 6-0 Nähte gesichert. Druck-Durchmesser-Tests wurden um die geschätzte physiologische Axialdehnung durchgeführt, um die Konformität und Tangentenmoduli9zu bestimmen. Es wurden Kraftlängentests durchgeführt, um die geschätzte axiale Dehnung zu bestätigen und sicherzustellen, dass die mechanischen Eigenschaften im physiologischen Bereich quantifiziert wurden. Das experimentelle Protokoll wurde an der nicht-schwangeren murinen Vagina und des Gebärmutterhalses im Alter von 4-6 Monaten in Estrus durchgeführt.
Das Protokoll ist in zwei mechanische Hauptprüfabschnitte unterteilt: Basalton und passive Tests. Ein Basalton ist definiert als die grundlegende partielle Verengung glatter Muskelzellen, selbst in Abwesenheit externer lokaler, hormoneller und neuronaler Stimulation10. Diese Basiskontraktilen Natur der Vagina und des Gebärmutterhalses ergibt charakteristische mechanische Verhaltensweisen, die dann durch das Druckmyographensystem gemessen werden. Die passiven Eigenschaften werden bewertet, indem das interzelluläre Kalzium entfernt wird, das den Ausgangszustand der Kontraktion beibehält, was zu einer Entspannung der glatten Muskelzellen führt. Im passiven Zustand liefern Kollagen- und Elastinfasern die dominierenden Beiträge für die mechanischen Eigenschaften der Organe.
Das murine Modell wird ausgiebig verwendet, um Pathologien in der reproduktiven Gesundheit von Frauen zu studieren. Die Maus bietet mehrere Vorteile für die Quantifizierung der sich entwickelnden Beziehungen zwischen ECM und mechanischen Eigenschaften innerhalb des Fortpflanzungssystems11,12,13,14. Zu diesen Vorteilen zählen kurze und gut charakterisierte Estre-Zyklen, relativ niedrige Kosten, einfache Handhabung und eine relativ kurze Trächtigkeitszeit15. Darüber hinaus ist das Genom von Labormäusen gut abgebildet und genetisch veränderte Mäuse sind wertvolle Werkzeuge, um mechanistische Hypothesen zu testen16,17,18.
Kommerziell erhältliche Druckmyographensysteme werden ausgiebig eingesetzt, um die mechanischen Reaktionen verschiedener Gewebe und Organe zu quantifizieren. Einige bemerkenswerte Strukturen auf dem Druck Myographsystem analysiert sind elastische Arterien19,20,21,22, Venen und Gewebe entwickelt Vaskuläre23,24, die Speiseröhre25und der Dickdarm26. Die Druckmyographentechnologie ermöglicht die gleichzeitige Beurteilung der Eigenschaften in axialer und umlaufender Richtung unter Beibehaltung der nativen Zell-ECM-Wechselwirkungen und der In-vivo-Geometrie. Trotz des umfangreichen Einsatzes von Myographensystemen in der Weichteil- und Organmechanik wurde bisher kein Protokoll mit der Druckmyographentechnologie für die Vagina und den Gebärmutterhals entwickelt. Vorherige Untersuchungen der mechanischen Eigenschaften der Vagina und des Gebärmutterhalses wurden uniaxial27,28. Diese Organe erleben jedoch eine multiaxiale Belastung im Körper29,30, daher ist die Quantifizierung ihrer biaxialen mechanischen Reaktion wichtig.
Darüber hinaus, neuere Arbeit legt nahe, dass glatte Muskelzellen eine mögliche Rolle in Weichgewebe-Pathologien5,28,31,32spielen können. Dies bietet eine weitere Attraktion der Nutzung der Druck-Myographen-Technologie, da sie die nativen Zell-Matrix-Wechselwirkungen bewahrt und so eine Abgrenzung des Beitrags ermöglicht, den glatte Muskelzellen in physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen. Hierin schlagen wir ein Protokoll vor, um die multiaxialen mechanischen Eigenschaften der Vagina und des Gebärmutterhalses sowohl unter Basalton als auch unter passiven Bedingungen zu quantifizieren.
Das in diesem Artikel enthaltene Protokoll stellt eine Methode zur Bestimmung der mechanischen Eigenschaften der murinen Vagina und des Gebärmutterhalses dar. Zu den in diesem Protokoll analysierten mechanischen Eigenschaften gehören sowohl die passiven als auch die basalen Tonbedingungen der Organe. Passive und basale Tonbedingungen werden durch eine Veränderung der biochemischen Umgebung induziert, in der das Organ untergetaucht ist. Für dieses Protokoll enthalten die an Basaltests beteiligten Medien Kalzium. Das T…
The authors have nothing to disclose.
Die Arbeit wurde durch den NSF CAREER-Preis #1751050 finanziert.
2F catheter | Millar | SPR-320 | catheter to measure cervical pressure |
6-0 Suture | Fine Science Tools | 18020-60 | larger suture ties |
CaCl2 (anhydrous) | VWR | 97062-590 | HBSS concentration: 140 mg/ mL |
CaCl2-2H20 | Fischer chemical | BDH9224-1KG | KRB concentration: 3.68 g/L |
Dextrose (D-glucose) | VWR | 101172-434 | HBSS concentration: 1000 mg/mL KRB concentration: 19.8 g/L |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | curved forceps |
Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11203-25 | straight forceps |
Eclipse | Nikon | E200 | microscope used for imaging |
Flow meter | Danish MyoTechnologies | 161FM | flow meter within the testing apparatus |
Force Transducer – 110P | Danish MyoTechnologies | 100079 | force transducer |
ImageJ | SciJava | ImageJ1 | used to measure volume |
Instrument Cases | Fine Science Tools | 20830-00 | casing to hold dissection tools |
KCl | Fisher Chemical | 97061-566 | HBSS concentration: 400 mg/ mL KRB concentration: 3.5 g/L |
KH2PO4 | G-Biosciences | 71003-454 | HBSS concentration: 60 mg/ mL |
MgCl2 | VWR | 97064-150 | KRB concentration: 1.14 g/L |
MgCl2-6H2O | VWR | BDH9244-500G | HBSS concentration: 100 mg/ mL |
MgSO4-7H20 | VWR | 97062-134 | HBSS concentration: 48 mg/ mL |
Mircosoft excel | Microsoft | 6278402 | program used for spreadsheet |
Na2HPO4 (dibasic anhydrous) | VWR | 97061-588 | HBSS concentration: 48 mg/mL KRB concentration: 1.44 g/L |
NaCl | VWR | 97061-274 | HBSS concentration: 8000 mg/mL KRB concentration: 70.1 g/L |
NaHCO3 | VWR | 97062-460 | HBSS concentration: 350 mg/ mL KRB concentration: 21.0 g/L |
Pressure myograph systems | Danish MyoTechnologies | 110P and 120CP | Pressure myograph system: prorgram, cannulation device, and controller unit |
Pressure Transducer | Danish MyoTechnologies | 100106 | pressure transducer |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | straight forceps |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | micro-scissors |
Tissue dye | Bradley Products | 1101-3 | ink to measure in vivo stretch |
Ultrasound transducer | FujiFilm Visual Sonics | LZ-550 | ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency |
VEVO2100 | FujiFilm Visual Sonics | VS-20035 | ultrasound used for imaging |
Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | larger scissors |