Биаксиальный базальный тон и пассивное тестирование репродуктивной системы Мурина с помощью миографа давления
Summary
Этот протокол использовал коммерчески доступную систему миографа давления для выполнения тестирования миографа давления на влагалище и шейке матки. Использование средств массовой информации с кальцием и без него, вклад гладких мышечных клеток (SMC) базального тона и пассивной внеклеточной матрицы (ECM) были изолированы для органов в предполагаемых физиологических условиях.
Abstract
В женских репродуктивных органах, в частности, влагалища ишейки матки, состоят различные клеточные компоненты и уникальная внеклеточная матрица (ECM). Гладкие мышечные клетки обладают сократительной функцией в стенках влагалища и шейки матки. В зависимости от биохимической среды и механического растяжения стенок органа, гладкие мышечные клетки изменяют сократительные условия. Вклад гладких мышечных клеток в базовых физиологических условиях классифицируется как базальный тон. В частности, базальный тон является базовым частичным сужением гладких мышечных клеток при отсутствии гормональной и нервной стимуляции. Кроме того, ECM обеспечивает структурную поддержку стенок органов и функционирует как резервуар для биохимических сигналов. Эти биохимические сигналы имеют жизненно важное значение для различных функций органов, таких как подстрекательство роста и поддержания гомеостаза. ECM каждого органа состоит в основном из коллагеновых волокон (в основном коллагена i, III и V), эластичных волокон и гликозаминогликанов/протеогликанов. Состав и организация ECM диктуют механические свойства каждого органа. Изменение состава ЭКМ может привести к развитию репродуктивных патологий, таких как пролапс тазовых органов или преждевременная ремоделирование шейки матки. Кроме того, изменения в микроструктуре ИКМ и жесткости могут изменить плавную активность мышечных клеток и фенотип, что приводит к потере сократительной силы.
В этой работе, сообщили протоколы используются для оценки базального тона и пассивных механических свойств небеременных муриновые влагалища и шейки матки в 4-6 месяцев в эструсе. Органы были установлены в коммерчески доступных миограф давления и как давление диаметра и силы длины испытаний были выполнены. Включены примерные данные и методы анализа данных для механической характеристики репродуктивных органов. Такая информация может быть полезна для построения математических моделей и рационального проектирования терапевтических вмешательств для патологий женского здоровья.
Introduction
Вагинальная стенка состоит из четырех слоев, эпителия, ламины проприии, мускулисиса и адвентиции. Эпителий в основном состоит из эпителиальных клеток. Ламинская проприя имеет большое количество эластичных и фибриллярных коллагеновых волокон. Muscleis также состоит из эластина и коллагеновых волокон, но имеет увеличенное количество гладких мышечных клеток. Пришествие состоит из эластина, коллагена и фибробластов, хотя и в сниженных концентрациях по сравнению с предыдущими слоями. Гладкие мышечные клетки представляют интерес для биомеханически мотивированных исследовательских групп, поскольку они играют роль в сократительный характер органов. Таким образом, количественная количественная фракция области мышечной клетки и организация является ключом к пониманию механической функции. Предыдущие исследования показывают, что гладкое содержание мышц в стенке влагалища в первую очередь организовано в окружной и продольной оси. Гистологический анализ показывает, что гладкая фракция области мышц составляет примерно 35% как для проксимальных, так и для дистальных участков стены1.
Шейка матки является очень коллагенома, что до недавнего времени, как считалось, имеют минимальное содержание гладких мышечных клеток2,3. Недавние исследования, однако, показали, что гладкие мышечные клетки могут иметь большее изобилие и роль в шейке матки4,5. Шейка матки имеет градиент гладких мышечных клеток. Внутренняя ос содержит 50-60% гладких мышечных клеток, где внешние os содержит только 10%. Мышь исследования, однако, сообщают шейки матки, которая состоит из 10-15% гладких мышечных клеток и 85-90% волокнистой соединительной ткани без упоминания региональных различий6,7,8. Учитывая, что модель мыши отличается от часто сообщаемой человеческой модели, необходимы дальнейшие исследования, касающиеся шейки матки мыши.
Целью этого протокола было выяснить механические свойства влагалища и шейки матки. Это было достигнуто с помощью устройства давления миографа, который позволяет оценить механические свойства в окружном и осевом направлениях одновременно при сохранении родных клеточных матричных взаимодействий и геометрии органов. Органы были установлены на двух пользовательских канюли и обеспечены шелком 6-0 швов. Испытания диаметра давления были проведены вокруг предполагаемого физиологического осевого участка для определения соответствия и касательных модули9. Были проведены испытания на длину силы для подтверждения предполагаемого растяжения осевой осевой нагрузки и обеспечения количественной оценки механических свойств в физиологическом диапазоне. Экспериментальный протокол был выполнен на небеременных мурина влагалища и шейки матки в 4-6 месяцев в эструсе.
Протокол разделен на два основных раздела механического тестирования: базальный тон и пассивное тестирование. Базальный тон определяется как базовое частичное сужение гладких мышечных клеток, даже при отсутствии внешних локальных, гормональных и нервной стимуляции10. Этот базовый контрактный характер влагалища и шейки матки дает характерные механические поведения, которые затем измеряются системой давления миографа. Пассивные свойства оцениваются путем удаления межклеточного кальция, который поддерживает базовое состояние сокращения, что приводит к расслаблению гладких мышечных клеток. В пассивном состоянии коллагеновы и эластинные волокна обеспечивают доминирующий вклад в механические характеристики органов.
Модель мурин широко используется для изучения патологий в репродуктивном здоровье женщин. Мышь предлагает несколько преимуществ для количественной оценки меняющихся отношений между ECM и механические свойства в репродуктивной системе11,12,13,14. Эти преимущества включают короткие и хорошо характерные эструсы циклы, относительно низкую стоимость, простоту обработки, и относительно короткое время гестационного15. Кроме того, геном лабораторных мышей хорошо отображается и генетически модифицированных мышей являются ценными инструментами для проверки механистической гипотезы16,17,18.
Коммерчески доступные системы миографа давления широко используются для количественной оценки механических реакций различных тканей и органов. Некоторые заметные структуры проанализированы на системе миографа давления вклюайте упругие артерии19,20,21,22,вены и ткани проектированные сосудистые трансплантаты23,24, пищевода25, и толстой кишки26. Технология давления миографа позволяет одновременно оценивать свойства в осевом и окружном направлениях при сохранении взаимодействия родной ячейки-ECM и геометрии in vivo. Несмотря на широкое использование миографных систем в мягких тканях и органной механике, протокол, в которых использовалась технология давления миографа, ранее не разрабатывался для влагалища и шейки матки. Предварительные исследования механических свойств влагалища и шейки матки были оценены униаксиально27,28. Эти органы, однако, опыт многоосевой нагрузки в организме29,30, таким образом, количественно их биаксиальной механической реакции имеет важное значение.
Кроме того, последние работы показывают, гладкие мышечные клетки могут играть потенциальную роль в патологии мягких тканей5,28,31,32. Это обеспечивает еще одну привлекательность использования технологии давления миографа, так как она сохраняет родные клеточные матрицы взаимодействий, тем самым позволяя разграничение вклада, что гладкие мышечные клетки играют в физиологических и патофизиологических Условия. В этом виде мы предлагаем протокол количественной оценки многоосных механических свойств влагалища и шейки матки как при базальном тоне, так и при пассивных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, представленный в этой статье представляет собой метод для определения механических свойств влагалища и шейки матки. Механические свойства, проанализированные в этом протоколе, включают как пассивные, так и базальные тональные условия органов. Пассивные и базальные условия ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа финансировалась за счет гранта NSF CAREER #1751050.
Materials
| 2F catheter | Millar | SPR-320 | catheter to measure cervical pressure |
| 6-0 Suture | Fine Science Tools | 18020-60 | larger suture ties |
| CaCl2 (anhydrous) | VWR | 97062-590 | HBSS concentration: 140 mg/ mL |
| CaCl2-2H20 | Fischer chemical | BDH9224-1KG | KRB concentration: 3.68 g/L |
| Dextrose (D-glucose) | VWR | 101172-434 | HBSS concentration: 1000 mg/mL KRB concentration: 19.8 g/L |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | curved forceps |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11203-25 | straight forceps |
| Eclipse | Nikon | E200 | microscope used for imaging |
| Flow meter | Danish MyoTechnologies | 161FM | flow meter within the testing apparatus |
| Force Transducer – 110P | Danish MyoTechnologies | 100079 | force transducer |
| ImageJ | SciJava | ImageJ1 | used to measure volume |
| Instrument Cases | Fine Science Tools | 20830-00 | casing to hold dissection tools |
| KCl | Fisher Chemical | 97061-566 | HBSS concentration: 400 mg/ mL KRB concentration: 3.5 g/L |
| KH2PO4 | G-Biosciences | 71003-454 | HBSS concentration: 60 mg/ mL |
| MgCl2 | VWR | 97064-150 | KRB concentration: 1.14 g/L |
| MgCl2-6H2O | VWR | BDH9244-500G | HBSS concentration: 100 mg/ mL |
| MgSO4-7H20 | VWR | 97062-134 | HBSS concentration: 48 mg/ mL |
| Mircosoft excel | Microsoft | 6278402 | program used for spreadsheet |
| Na2HPO4 (dibasic anhydrous) | VWR | 97061-588 | HBSS concentration: 48 mg/mL KRB concentration: 1.44 g/L |
| NaCl | VWR | 97061-274 | HBSS concentration: 8000 mg/mL KRB concentration: 70.1 g/L |
| NaHCO3 | VWR | 97062-460 | HBSS concentration: 350 mg/ mL KRB concentration: 21.0 g/L |
| Pressure myograph systems | Danish MyoTechnologies | 110P and 120CP | Pressure myograph system: prorgram, cannulation device, and controller unit |
| Pressure Transducer | Danish MyoTechnologies | 100106 | pressure transducer |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | straight forceps |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | micro-scissors |
| Tissue dye | Bradley Products | 1101-3 | ink to measure in vivo stretch |
| Ultrasound transducer | FujiFilm Visual Sonics | LZ-550 | ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency |
| VEVO2100 | FujiFilm Visual Sonics | VS-20035 | ultrasound used for imaging |
| Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | larger scissors |
References
- Capone, D., et al. Evaluating Residual Strain Throughout the Murine Female Reproductive System. Journal of Biomechanics. 82, 299-306 (2019).
- Danforth, D. The fibrous nature of the human cervix, and its relation to the isthmic segment in gravid and nongravid uteri. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 53 (4), 541-560 (1947).
- Hughesdon, P. The fibromuscular structure of the cervix and its changes during pregnancy and labour. Journal of Obstetrics and Gynecology of the British Commonwealth. 59, 763-776 (1952).
- Bryman, I., Norstrom, A., Lindblo, B. Influence of neurohypophyseal hormones on human cervical smooth muscle cell contractility in vitro. Obstetrics and Gynecology. 75 (2), 240-243 (1990).
- Joy, V., et al. A New Paradigm for the Role of Smooth Muscle Cells in the Human Cervix. Obstetrics. 215 (4), e471-e478 (2016).
- Xu, X., Akgul, Y., Mahendroo, M., Jerschow, A. Ex vivo assessment of mouse cervical remodeling through pregnancy via Na (23) MRS. NMR Biomedical. 23 (23), 907-912 (2014).
- Leppert, P. Anatomy and Physiology of cervical ripening. Clinical Obstetrics and Gynecology. 43 (43), 433-439 (2000).
- Schlembach, D., et al. Cervical ripening and insufficiency: from biochemical and molecular studies to in vivo clinical examination. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 144, S70-S79 (2000).
- Stoka, K., et al. Effects of Increased Arterial Stiffiness on Atherosclerotic Plaque Amounts. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (5), (2018).
- Mohram, D., Heller, L. Ch. 7. Cardiovascular Physiology. , (2006).
- Yoshida, K., et al. Quantitative Evaluation of Collagen Crosslinks and Corresponding Tensile Mechanical Properties in Mouse Cervical Tissue during Normal Pregnancy. PLoS One. 9, e112391 (2014).
- Mahendroo, M. Cervical remodeling in term and preterm birth: insight from an animal model. Society for Reproduction and Fertility. 143 (4), 429-438 (2012).
- Elovitz, M., Miranlini, C. Can medroxyprogesterone acetate alter Toll-like receptor expression in a mouse model of intrauterine inflammation?. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 193 (3), 1149-1155 (2005).
- Ripperda, C., et al. Vaginal estrogen: a dual-edged sword in postoperative healing of the vaginal wall. North American Menopause Society. 24 (7), 838-849 (2017).
- Nelson, J., Felicio, P., Randall, K., Sims, C., Finch, E. A Longitudinal Study of Estrous Cyclicity in Aging C57/6J Mice: Cycle, Frequency, Length, and Vaginal Cytology. Biology of Reproduction. 27 (2), 327-339 (1982).
- Ferruzzi, J., Collins, M., Yeh, A., Humphrey, J. Mechanical assessment of elastin integrity in fibrillin-1-deficient carotid arteries: implications for Marfan Syndrome. Cardiovascular Research. 92 (2), 287-295 (2011).
- Mariko, B., et al. Fribrillin-1 genetic deficiency leads to pathological ageing of arteries in mice. The Journal of Pathology. 224 (1), 33-44 (2011).
- Rahn, D., Ruff, M., Brown, S., Tibbals, H., Word, R. Biomechanical Properties of The Vaginal Wall: Effect of Pregnancy, Elastic Fiber Deficiency, and Pelvic Organ Prolapse. American Urogynecological Society. 198 (5), (2009).
- Caulk, A., Nepiyushchikh, Z., Shaw, R., Dixon, B., Gleason, R. Quantification of the passive and active biaxial mechanical behavior and microstructural organization of rat thoracic ducts. Royal Society Interface. 12 (108), 20150280 (2015).
- Amin, M., Le, V., Wagenseil, J. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. Journal of Visualized Experiments. (60), e3733 (2012).
- Sokolis, D., Sassani, S., Kritharis, E., Tsangaris, S. Differential histomechanical response of carotid artery in relation to species and region: mathematical description accounting for elastin and collagen anisiotropy. Medical and Biological Engineering and Computing. 49 (8), 867-879 (2011).
- Kim, J., Baek, S. Circumferential variations of the mechanical behavior of the porcine thoracic aorta during the inflation test. Journal of Biomechanics. 44 (10), 1941-1947 (2011).
- Faury, G., et al. Developmental adaptation of the mouse cardiovascular system to elastin haploinsufficency. Journal of Clinical Investigation. 11 (9), 1419-1428 (2003).
- Naito, Y., et al. Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue-Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model. Tissue Engineering. 20, 346-355 (2014).
- Sommer, G., et al. Multaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).
- Sokolis, D., Orfanidis, I., Peroulis, M. Biomechanical testing and material characterization for the rat large intestine: regional dependence of material parameters. Physiological Measurement. 32 (12), 1969-1982 (2011).
- Martins, P., et al. Prediction of Nonlinear Elastic Behavior of Vaginal Tissue: Experimental Results and Model Formation. Computational Methods of Biomechanics and Biomedical Engineering. 13 (3), 317-337 (2010).
- Feola, A., et al. Deterioration in Biomechanical Properties of the Vagina Following Implantation of a High-stiffness Prolapse Mesh. BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 120 (2), 224-232 (2012).
- Huntington, A., Rizzuto, E., Abramowitch, S., Prete, Z., De Vita, R. Anisotropy of the Passive and Active Rat Vagina Under Biaxial Loading. Annals of Biomedical Engineering. 47, 272-281 (2018).
- Tokar, S., Feola, A., Moalli, P., Abramowitch, S. Characterizing the Biaxial Mechanical Properties of Vaginal Maternal Adaptations During Pregnancy. ASME 2010 Summer Bioengineering Conference, Parts A and B. , 689-690 (2010).
- Feloa, A., et al. Impact of Pregnancy and Vaginal Delivery on the Passive and Active Mechanics of the Rat Vagina. Annals of Biomedical Engineering. 39 (1), 549-558 (2010).
- Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. Mechanical Analysis of the Uterosacral Ligament: Swine vs Human. Annual Biomedical Engineering. 46 (12), 2036-2047 (2018).
- Champlin, A. Determining the Stage of the Estrous Cycle in the Mouse by the Appearance. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
- Byers, S., Wiles, M., Dunn, S., Taft, R. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).
- McLean, A. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. 67, e4389 (2012).
- Bugg, G., Riley, M., Johnston, T., Baker, P., Taggart, M. Hypoxic inhibition of human myometrial contractions in vitro: implications for the regulation of parturition. European Journal of Clinical Investigation. 36 (2), 133-140 (2006).
- Taggart, M., Wray, S. Hypoxia and smooth muscle function: key regulatory events during metabolic stress. Journal of Physiology. 509, 315-325 (1998).
- Yoo, K., et al. The effects of volatile anesthetics on spontaneous contractility of isolated human pregnant uterine muscle: a comparison among sevoflurane, desflurane, isoflurane, and halothane. Anesthesia and Analgesia. 103 (2), 443-447 (2006).
- de Souza, L., et al. Effects of redox disturbances on intentional contractile reactivity in rats fed with a hypercaloric diet. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 6364821 (2018).
- Jaue, D., Ma, Z., Lee, S. Cardiac muscarinic receptor function in rats with cirrhotic cardiomyopathy. Hepatology. 25, 1361-1365 (1997).
- Xu, Q., Shaffer, E. The potential site of impaired gallbladder contractility in an animal mode of cholesterol gallstone disease. Gastroenterology. 110 (1), 251-257 (1996).
- Rodriguez, U., et al. Effects of blast induced Neurotrauma on pressurized rodent middle cerebral arteries. Journal of Visualized Experimentals. (146), e58792 (2019).
- Rubod, C., Boukerrou, M., Brieu, M., Dubois, P., Cosson, M. Biomechanical Properties of Vaginal Tissue Part 1: New Experimental Protocol. Journal of Urology. 178, 320-325 (2007).
- Robison, K., Conway, C., Desrosiers, L., Knoepp, L., Miller, K. Biaxial Mechanical Assessment of the Murine Vaginal Wall Using Extension-Inflation Testing. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 104504 (2017).
- Van loon, P. Length-Force and Volume-Pressure Relationships of Arteries. Biorheology. 14 (4), 181-201 (1977).
- Fernandez, M., et al. Investigating the Mechanical Function of the Cervix During Pregnancy using Finite Element Models Derived from High Resolution 3D MRI. Computational Methods Biomechanical and Biomedical Engineering. 19 (4), 404-417 (2015).
- House, M., Socrate, S. The Cervix as a Biomechanical Structure. Ultrasound Obstetric Gynecology. 28 (6), 745-749 (2006).
- Martins, P., et al. Biomechanical Properties of Vaginal Tissue in Women with Pelvic Organ Prolapse. Gynecologic and Obstetrics Investigation. 75, 85-92 (2013).
- Rada, C., Pierce, S., Grotegut, C., England, S. Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In vivo. Journal of Visualized Experiments. (98), e52541 (2015).
- Lumsden, M. A., Baird, D. T. Intra-uterine pressure in dysmenorrhea. Acta Obstectricia at Gynecologica Scandinavica. 64 (2), 183-186 (1985).
- Milsom, I., Andersch, B., Sundell, G. The Effect of Flurbiprofen and Naproxen Sodium On Intra-Uterine Pressure and Menstrual Pain in Patients With Primary Dysmennorrhea. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 67 (8), 711-716 (1988).
- Park, K., et al. Vasculogenic female sexual dysfunction: the hemodynamic basis for vaginal engorgement insufficiency and clitoral erectile insufficiency. International Journal of Impotence Journal. 9 (1), 27-37 (1997).
- Bulletti, C., et al. Uterine Contractility During Menstrual Cycle. Human Reproduction. 15, 81-89 (2000).
- Kim, N. N., et al. Effects of Ovariectomy and Steroid Hormones on Vaginal Smooth Muscle Contractility. International Journal of Impotence Research. 16, 43-50 (2004).
- Giraldi, A., et al. Morphological and Functional Characterization of a Rat Vaginal Smooth Muscle Sphincter. International Journal of Impotence Research. 14, 271-282 (2002).
- Gleason, R., Gray, S. P., Wilson, E., Humphrey, J. A Multiaxial Computer-Controlled Organ Culture and Biomechanical Device for Mouse Carotid Arteries. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (6), 787-795 (2005).
- Swartz, M., Tscumperlin, D., Kamm, R., Drazen, J. Mechanical Stress is Communicated Between Different Cell Types to Elicit Matrix Remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (11), 6180-6185 (2001).
- Rachev, A. Remodeling of Arteries in Response to Changes in their Mechanical Environment. Biomechanics of Soft Tissue in Cardiovascular Systems. 441, 221-271 (2003).
- Lee, E. J., Holmes, J., Costa, K. Remodeling of Engineered Tissue Anisotropy in Response to Altered Loading Conditions. Annals of Biomedical Engineering. 36 (8), 1322-1334 (2008).
- Akintunde, A., et al. Effects of Elastase Digestion on the Murine Vaginal Wall Biaxial Mechanical Response. Journal of Biomechanical Engineering. 141 (2), 021011 (2018).
- Griffin, M., Premakumar, Y., Seifalian, A., Butler, P., Szarko, M. Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing. Journal of Visualized Experiments. (118), e54872 (2016).
- Myers, K., Socrate, S., Paskaleva, A., House, M. A Study of the Anisotripy and Tension/Compression Behavior of Human Cervical Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 132 (2), 021003 (2010).
- Murtada, S., Ferruzzi, J., Yanagisawa, H., Humphrey, J. Reduced Biaxial Contractility in the Descending Thoracic Aorta of Fibulin-5 Deficent Mice. Journal of Biomechanical Engineering. 138 (5), 051008 (2016).
- Berkley, K., McAllister, S., Accius, B., Winnard, K. Endometriosis-induced vaginal hyperalgesia in the rat: effect of estropause, ovariectomy, and estradiol replacement. Pain. 132, s150-s159 (2007).
- van der Walt, I., Bø, K., Hanekom, S., Rienhardt, G. Ethnic Differences in pelvic floor muscle strength and endurance in South African women. International Urogynecology Journal. 25 (6), 799-805 (2014).
