Culture primaire des neurones isolés du cervelet de souris embryonnaire
Summary
Mener des expériences in vitro pour refléter les conditions in vivo aussi adéquatement que possible n’est pas une tâche facile. L’utilisation des cultures cellulaires primaires est une étape importante vers la compréhension de la biologie cellulaire dans un organisme entier. Le protocole fourni décrit comment se développer avec succès et cultiver les neurones cérévelaires embryonnaires de souris.
Abstract
L’utilisation des cultures cellulaires primaires est devenue l’un des principaux outils d’étude du système nerveux in vitro. L’objectif ultime de l’utilisation de ce système modèle simplifié est de fournir un microenvironnement contrôlé et de maintenir le taux de survie élevé et les caractéristiques naturelles des cellules neuronales et non neuronales dissociées autant que possible dans des conditions in vitro. Dans cet article, nous démontrons une méthode d’isoler les neurones primaires du cervelet de souris en développement, les plaçant dans un environnement in vitro, établissant leur croissance, et de surveiller leur viabilité et différenciation pendant plusieurs semaines. Cette méthode s’applique aux neurones embryonnaires dissociés du cervelet entre les jours embryonnaires 12-18.
Introduction
Pendant plusieurs décennies, les lignées cellulaires ont été largement utilisées comme un outil à haut débit dans les études précliniques et la recherche biologique. La rentabilité, la croissance rapide et la réduction de l’utilisation des animaux vivants sont quelques avantages de l’utilisation de ces cellules. Cependant, les altérations génétiques et les changements phénotypiques s’accumulent après plusieurs passages in vitro1. Une mauvaise identification des lignées cellulaires et la dissemblance génétique des cellules primaires peuvent conduire à des expériences irréproductibles et à de fausses conclusions2,3,4,5. Par conséquent, en dépit de certaines similitudes avec les cellules différenciées telles que les neurones (par exemple, les neurotransmetteurs, les canaux ioniques, les récepteurs et d’autres protéines spécifiques aux neurones), les lignées cellulaires neuronales ne peuvent pas reproduire le phénotype complet des neurones. L’utilisation de neurones matures est une autre option; cependant, ces cellules sont des cellules postmitotic non-divisant qui sont difficiles à propager dans la culture. En outre, la rentrée dans le cycle cellulaire peut précipiter l’apoptose6.
La culture cellulaire tridimensionnelle (3D), les cultures de tranches organotypiques et les cultures organoïdes ont été développées pour fournir un environnement dans lequel les cellules peuvent s’arranger en une forme 3D qui imite le cadre in vivo. Ainsi, la communication de cellule à cellule, la migration, l’invasion des cellules tumorales dans les tissus environnants, et l’angiogenèse peuvent être étudiées7. Cependant, les coûts supplémentaires liés à l’utilisation de protéines de matrice cellulaire supplémentaire (ECM) ou d’hydrogels synthétiques comme literie, difficulté à l’imagerie et compatibilité avec les instruments de criblage à haut débit sont des inconvénients considérables de la culture des cellules 3D. Un inconvénient majeur de la culture de tranches de tissu organotypic est l’utilisation d’un grand nombre d’animaux et les effets néfastes de l’axotomie, qui conduit à l’inaccessibilité des cibles et des facteurs de croissance pour les axones, et par conséquent la mort neuronale8.
Par conséquent, une approche alternative, qui évite les problèmes avec les lignées cellulaires, la difficulté de cultiver des cellules matures, et la complexité des tissus, est la maturation in vitro des cellules primaires immatures. Les cellules primaires sont dérivées directement de tissus humains ou animaux et dissociées à l’aide de méthodes enzymatiques et/ou mécaniques9. Les principes principaux de l’isolement, de l’ensemencement, et de l’entretien dans le milieu de culture sont semblables indépendamment de la source de tissu. Cependant, les facteurs trophiques nécessaires pour favoriser la prolifération et la maturation sont très spécifiques aux cellules6.
Connaître la « date de naissance » de chaque type de cellule cérétylée est une condition préalable à la conception d’une expérience de culture primaire. En général, les cellules Purkinje (PC) et les neurones des noyaux cérécoés (CN) naissent avant les cellules plus petites, y compris les interneurones (p. ex. panier, cellules stellates) et les cellules granules. Chez la souris, les PC émergent entre le jour embryonnaire (E)10-E13, tandis que les neurones du CN à environ E9-E1210.
D’autres neurones cérétoraux naissent beaucoup plus tard. Par exemple, chez la souris, la sous-population golgi d’interneurones est générée à partir de La ZV à l’e14-E18 et les interneurones restants (cellules de panier et cellules stellates) situés dans la couche moléculaire émergent de la division des cellules progénitrices dans la matière blanche entre les premiers postnatal (P)0-P711. Les cellules granules sont générées à partir de la zone germinale externe (EGZ), une zone germinale secondaire qui est dérivée de la lèvre rhombique rostrale et passe par la division terminale après la naissance. Mais avant que leurs précurseurs ne proviennent de la lèvre rhombique de l’E13-E16, les cellules ont déjà migré vers le rostale le long de la surface de la pia pour faire une mince couche de cellules sur la surface dorsale de l’anlage du cervelet. Les cellules macrogliales non neuronales telles que les astrocytes et les oligodendrocytes, qui proviennent du neuroepithelium ventriculaire, naissent respectivement à E13.5-P0 et P0-P711,12,13,14 ,15. Les microglies sont dérivées de cellules progénitrices myéloïdes primitives jaune-sac entre E8-E10 et après l’invasion dans le système nerveux central peut être détectée dans le cerveau de la souris par E916.
La méthode présentée dans cet article est basée sur celle développée à l’origine par Furuya et coll. et Tabata et al.17,18, qui a été optimisée pour la culture primaire des cellules de Purkinje dérivées du cervelèle de rat Wistar. Nous avons maintenant adapté cette méthode et soigneusement modifié pour étudier la croissance des neurones céréveleux souris19. Contrairement à notre nouveau protocole, le milieu de dissection à froid est le tampon de lavage principal utilisé pendant les étapes de dissection et de dissociation avant d’ajouter le milieu d’ensemencement dans le protocole17de Furuya. Ce tampon n’a pas la nutrition, les facteurs de croissance et les hormones (tous dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco : mélange nutritif F-12 [DMEM/F12]) qui sont nécessaires pour soutenir la croissance et la survie des cellules pendant les étapes susmentionnées. En outre, sur la base de notre vaste expérience avec les cultures cérévelaires primaires murines, nous avons utilisé 500 L de milieu de culture dans chaque puits (au lieu de 1 ml) et augmenté la concentration de tri-iodothyronine à 0,5 ng/mL, ce qui améliore la croissance des cellules neuronales, en en particulier ceux avec un phénotype de cellules de Purkinje, et favorise la croissance des branches dendritiques dans la culture. La méthode principale décrite dans cet article peut être largement appliquée à d’autres petits rongeurs (par exemple, les écureuils et les hamsters) pendant le développement embryonnaire et peut être employée pour étudier la neurogenèse et la différenciation de cervelateur dans les divers stades embryonnaires, qui diffèrent d’une espèce à l’autre.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’utilisation des cultures primaires est une méthode bien connue applicable à tous les types de neurones17,18,19. Dans le protocole présenté, nous expliquons comment isoler les neurones cérévelaires et maintenir leur viabilité avec une survie optimale in vitro pendant un maximum de 3 semaines. La culture primaire des cellules cérévelaires, qui ont été isolées à E15-E18, confirme la collecte de trois classes de grand…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces études ont été appuyées par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (HM : Subvention à la découverte du CRSNG – RGPIN-2018-06040), et de l’Institut de recherche des hôpitaux pour enfants du Manitoba (HM : Subvention no 320035) et de la SLA Canada-Brain Canada Arthur J. Hudson Translational Team Grant (JK, HM).
Materials
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | fisher scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
References
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