Первичная культура нейронов, изолированных от эмбриональной мыши Cerebellum
Summary
Проведение экспериментов в пробирке, чтобы отразить в условиях vivo как можно более адекватно, не является легкой задачей. Использование первичных клеточных культур является важным шагом на пути к пониманию клеточной биологии в целом организме. В предоставленном протоколе описывается, как успешно расти и культуры эмбриональных нейронов мозжечка мыши.
Abstract
Использование первичных клеточных культур стало одним из основных инструментов для изучения нервной системы in vitro. Конечная цель использования этой упрощенной модели системы заключается в обеспечении контролируемой микросреды и поддерживать высокий уровень выживаемости и природные особенности разрозненных нейрональных и ненейрональных клеток как можно больше в условиях in vitro. В этой статье мы демонстрируем метод изоляции первичных нейронов от развивающегося мозжечка мыши, помещая их в среду in vitro, устанавливая их рост, и контролируя их жизнеспособность и дифференциацию в течение нескольких недель. Этот метод применим к эмбриональным нейронам, диссоциированным от мозжечка между эмбриональными днями 12–18.
Introduction
В течение нескольких десятилетий клеточные линии широко использовались в качестве инструмента высокой пропускной связи в доклинических исследованиях и биологических исследованиях. Рентабельность, быстрый рост и сокращение использования живых животных являются некоторыми преимуществами использования этих клеток. Однако генетические изменения и фенотипические изменения накапливаются после нескольких проходов in vitro1. Неверная идентификация клеточных линий и генетическая несходность первичных клеток может привести к невоспроизводимым экспериментам и ложным выводам2,3,4,5. Поэтому, несмотря на некоторое сходство с дифференцированными клетками, такими как нейроны (например, нейротрансмиттеры, ионные каналы, рецепторы и другие нейронно-специфические белки), нейронные клеточные линии не могут воспроизвести полный фенотип нейронов. Использование зрелых нейронов является еще одним вариантом; однако, эти клетки не разделяют постмитотические клетки, которые трудно размножаться в культуре. Кроме того, возвращение в клеточный цикл может привести к апоптозу6.
Трехмерная (3D) клеточная культура, органотипические срезные культуры и органоидные культуры были разработаны, чтобы обеспечить среду, в которой клетки могут организовать сявру в 3D-форму, имитирующую настройку in vivo. Таким образом, клеточной связи, миграции, вторжения опухолевых клеток в окружающие ткани, и ангиогенез можно изучить7. Однако дополнительные затраты на использование дополнительных клеточных матричных (ECM) белков или синтетических гидрогелей в качестве постельных принадлежностей, трудности в визуализации и совместимость с высокопроизводительными скрининговыми инструментами являются значительными недостатками культивирования 3D-клеток. Основным недостатком культуры органотипических срезов тканей является использование большого количества животных и неблагоприятные последствия акотомии, что приводит к недоступности целей и факторов роста для аксонов, и, следовательно, нейрональной смерти8.
Таким образом, альтернативный подход, который позволяет избежать проблем с клеточными линиями, трудности выращивания зрелых клеток, и сложность тканей, является в пробирке созревания незрелых первичных клеток. Первичные клетки получены непосредственно из тканей человека или животного и разобщены с помощью ферментативных и/или механических методов9. Основные принципы изоляции, посева и поддержания в культурной среде схожи независимо от источника ткани. Тем не менее, трофические факторы, необходимые для содействия распространению и созреванию являются весьма клеточными6.
Знание «даты рождения» каждого типа мозжечковой клетки является необходимым условием для разработки первичного эксперимента культуры. В целом, клетки Пуркинье (ПК) и нейроны мочеиссолочных ядер (CN) рождаются перед более мелкими клетками, включая интернейроны (например, корзины, стеллатные клетки) и гранулированные клетки. У мышей, ПК возникают между эмбриональным днем (E)10-E13, в то время как CN нейронов примерно E9-E1210.
Другие мозжечковые нейроны рождаются гораздо позже. Например, у мышей субпопуляция межнейронов Голги генерируется из ВЗ на уровне (E14-E18), а остальные интернейроны (клетки корзины и стеллатные клетки), расположенные в молекулярном слое, возникают из деления клеток-прародителей в белом веществе между ранними послеродовой (P)0-P711. Клетки гранул генерируются из внешней зародышевой зоны (ЭГЗ), вторичной зародышевой зоны, которая происходит от ростральной ромбических губ и проходит через терминальное деление после рождения. Но прежде чем их предшественники возникают из ромбических губ от E13-E16, клетки уже мигрировали ростально вдоль поверхности пиа, чтобы сделать тонкий слой клеток на поверхности вращателя алаг. Ненейрональные макроглиальные клетки, такие как астроциты и олигодендроциты, которые происходят из желудочкового нейроэпителия, рождаются в E13.5-P0 и P0-P7 соответственно11,12,13,14 ,15. Микроглия являются производными от желтка-мешок примитивных миелоидных клеток-прародителей между E8-E10 и после вторжения в центральную нервную систему могут быть обнаружены в мозге мыши E916.
Метод, представленный в этой статье, основан на методе, первоначально разработанном Furuya et al. и Tabata et al.17,18,который был оптимизирован для первичного культивирования клеток Пуркинье, полученных из крысиной церебеллы Wistar. Теперь мы адаптировали этот метод и тщательно модифицировали его для изучения роста мозжечковых нейронов мыши19. В отличие от нашего нового протокола, холодная среда вскрытия является основным буфером стирки, используемым во время рассечения и диссоциации, прежде чем добавить среду посева в протокол Furuya17. Этот буфер не хватает питания, факторов роста и гормонов (все в Dulbecco в модифицированных Eagle среды: питательная смесь F-12 “DMEM / F12”), которые необходимы для поддержки роста клеток и выживания во время вышеупомянутых шагов. Кроме того, основываясь на нашем обширном опыте работы с мурин первичных мозжечковых культур, мы использовали 500 л культуры среды в каждом колодце (вместо 1 мл) и увеличили концентрацию трийотиронина до 0,5 нг/мл, что улучшает рост нейрональных клеток, в частности те с фенотипом клетки Purkinje, и повышают outgrowth dendritic ветвей в культуре. Основной метод, описанный в этой статье, может быть широко применен к другим мелким грызунам (например, белкам и хомятам) во время эмбрионального развития и может быть использован для изучения мозжечкового нейрогенеза и дифференциации на различных эмбриональных стадиях, которые различаются между видами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование первичных культур является хорошо известным методом, применимым для всех типов нейронов17,18,19. В представленном протоколе мы объясняем, как изолировать мозжечковые нейроны и поддерживать их жизнеспособность с оптимальн?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эти исследования были поддержаны грантами От Совета естественных наук и инженерных исследований (HM: NSERC Discovery Грант – RGPIN-2018-06040), а также Детский госпиталь научно-исследовательский институт Манитобы (HM: Грант No 320035), и ALS Канада-Мозг Канады Артур J. Хадсон Переводная команда Грант (JK, HM).
Materials
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | fisher scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
References
- Giffard, R. G., Ouyang, Y. B., Squire, L. R. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. , 633-637 (2009).
- Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurosciences. 305, 86-98 (2015).
- Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , (2017).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
- Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
- Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
- Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
- Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
- Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) – A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
- Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
- Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
- Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A., Barh, D., Azevedo, V. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. , 391-429 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
- Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
